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小汰宝

铁虫 (小有名气)

[求助] RBS+第一个蛋白(有终止密码子)+第二个蛋白(有终止密码子),会正常表达吗?已有1人参与

想构建2个蛋白在pet28a载体上。序列大概是:

T7启动子——RBS——第一个蛋白(有终止密码子)——78bp (血清酶切割位点和T7 tag)——第二个蛋白(有终止密码子)

第二个蛋白前是没有RBS的

请问这样第二个蛋白能正常表达吗?还是第二个蛋白表达量会少一点?还是第二个蛋白因为没有RBS所以根本不会有表达?


求助,感谢。
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pennchem

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
翻译蛋白,需要核糖体结合mRNA

如果没有核糖体结合位点(ribosome binding site),核糖体结合的可能性会低很多,意味着蛋白表达的可能性会低很多。

现在有很多双表达的质粒,插入MCS1和MCS2就可以同时表达两个基因。

或者只有一个RBS,但是第一个基因以TAA结尾,第二个基因以ATG开头,中间重合一个A,TAATG,核糖体在翻译完第一个基因后,距离第二个基因很近,也能把第二个基因翻译了。事实上,很多病毒基因就是这么排列的。

以上只是分析,一切还是看实验结果。你的第二个基因表达了么?
行至水穷处,坐看云起时
2楼2021-02-06 10:03:07
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小汰宝

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by pennchem at 2021-02-06 10:03:07
翻译蛋白,需要核糖体结合mRNA

如果没有核糖体结合位点(ribosome binding site),核糖体结合的可能性会低很多,意味着蛋白表达的可能性会低很多。

现在有很多双表达的质粒,插入MCS1和MCS2就可以同时表达两 ...

太感谢了!

我是在构建一个融合蛋白突变库的时候,找到一个突变体,效果特别好,但是测序发现这个突变体序列在in fusion连接的时候发生了错配,完全没有按我们预计的走,却表现出了较高的蛋白2的酶活和极少的包涵体,所以很困惑。

设计的融合蛋白突变库的构建:
T7启动子——RBS——第一个蛋白做随机突变(无终止密码子)——78bp (血清酶切割位点和T7 tag)——第二个蛋白(有终止密码子)

找到的这个的hit:
T7启动子——RBS——第一个蛋白,有随机突变,但是大约只有原蛋白前3/4部分(有终止密码子)——78bp (血清酶切割位点和T7 tag)——第一个蛋白有随机突变,但是大约只有原蛋白前1/2部分(无终止密码子)——78bp (血清酶切割位点和T7 tag)——第二个蛋白(有终止密码子)

这个hit等于变成了我题目中问的那个样子。

测序应该没有问题,此序列来自双向测序结果。

这个hit做蛋白2的催化,表现非常好。现在不知道怎么解释这个机理机制,毕竟原以为发生这种错连的突变,蛋白2应该没表达才对。
3楼2021-02-06 10:17:15
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pennchem

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

很有意思的发现,如果是我,会往下做实验

(1)将78bp的序列置换成不同序列,看是否影响基因2的表达
(2)将基因2置换成其他基因,看是否也可以高效表达
(3)如果蛋白2可以纯化的话,纯化后进行N端测序,看是否是同一个其实位点
行至水穷处,坐看云起时
4楼2021-02-06 10:29:19
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