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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » RBS+第一个蛋白（有终止密码子）+第二个蛋白（有终止密码子），会正常表达吗？
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小汰宝

铁虫 (小有名气)

[求助] RBS+第一个蛋白（有终止密码子）+第二个蛋白（有终止密码子），会正常表达吗？已有1人参与

想构建2个蛋白在pet28a载体上。序列大概是：

T7启动子——RBS——第一个蛋白（有终止密码子）——78bp （血清酶切割位点和T7 tag）——第二个蛋白（有终止密码子）

第二个蛋白前是没有RBS的

请问这样第二个蛋白能正常表达吗？还是第二个蛋白表达量会少一点？还是第二个蛋白因为没有RBS所以根本不会有表达？


求助，感谢。
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1楼2021-02-05 22:28:55
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pennchem

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
翻译蛋白，需要核糖体结合mRNA

如果没有核糖体结合位点（ribosome binding site），核糖体结合的可能性会低很多，意味着蛋白表达的可能性会低很多。

现在有很多双表达的质粒，插入MCS1和MCS2就可以同时表达两个基因。

或者只有一个RBS，但是第一个基因以TAA结尾，第二个基因以ATG开头，中间重合一个A，TAATG，核糖体在翻译完第一个基因后，距离第二个基因很近，也能把第二个基因翻译了。事实上，很多病毒基因就是这么排列的。

以上只是分析，一切还是看实验结果。你的第二个基因表达了么？
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行至水穷处，坐看云起时
2楼2021-02-06 10:03:07
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小汰宝

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by pennchem at 2021-02-06 10:03:07
翻译蛋白，需要核糖体结合mRNA

如果没有核糖体结合位点（ribosome binding site），核糖体结合的可能性会低很多，意味着蛋白表达的可能性会低很多。

现在有很多双表达的质粒，插入MCS1和MCS2就可以同时表达两 ...

太感谢了！

我是在构建一个融合蛋白突变库的时候，找到一个突变体，效果特别好，但是测序发现这个突变体序列在in fusion连接的时候发生了错配，完全没有按我们预计的走，却表现出了较高的蛋白2的酶活和极少的包涵体，所以很困惑。

设计的融合蛋白突变库的构建：
T7启动子——RBS——第一个蛋白做随机突变（无终止密码子）——78bp （血清酶切割位点和T7 tag）——第二个蛋白（有终止密码子）

找到的这个的hit:
T7启动子——RBS——第一个蛋白，有随机突变，但是大约只有原蛋白前3/4部分（有终止密码子）——78bp （血清酶切割位点和T7 tag）——第一个蛋白有随机突变，但是大约只有原蛋白前1/2部分（无终止密码子）——78bp （血清酶切割位点和T7 tag）——第二个蛋白（有终止密码子）

这个hit等于变成了我题目中问的那个样子。

测序应该没有问题，此序列来自双向测序结果。

这个hit做蛋白2的催化，表现非常好。现在不知道怎么解释这个机理机制，毕竟原以为发生这种错连的突变，蛋白2应该没表达才对。
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3楼2021-02-06 10:17:15
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pennchem

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

很有意思的发现，如果是我，会往下做实验

（1）将78bp的序列置换成不同序列，看是否影响基因2的表达
（2）将基因2置换成其他基因，看是否也可以高效表达
（3）如果蛋白2可以纯化的话，纯化后进行N端测序，看是否是同一个其实位点
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行至水穷处，坐看云起时
4楼2021-02-06 10:29:19
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