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有关药品冻干工艺设计的实用建议
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冻干工艺设计与优化一直是一个难点，特别是对于新手来讲，可能阅读了大量的文献和书籍都不得其法，反而越感困惑。小编在此将《Design of Freeze-Drying Processes for Pharmaceuticals: Practical Advice ，Xiaolin (Charlie) Tang and Michael J. Pikal 》编译给各位读者，希望各位可以在攻克冻干这个知识点的路上少走弯路，这篇综述文献内容是极好的，强烈建议去研读原文。 如果觉的文章对您有帮助的话，请关注微信公众号 识药事，关注作者木小木哈 前言 冻干被广泛用于药物，以提高不稳定药物尤其是蛋白质药物的稳定性和长期储存稳定性。冻干制剂不仅具有更好的稳定性，而且易于运输和储存。 冻干是一项耗能的过程，如果不对冻干工艺进行优化，则可能需要数天甚至数周的时间。 药品储存期间的稳定性和冻干工艺持续时间是优化冻干工艺的两个主要考虑因素。 为了设计最佳的冷冻干燥工艺，工艺开发科学家需要了解配方的关键特性以及如何将此信息应用于工艺设计。关键的制剂性质包括制剂的崩塌温度，药物的稳定性以及所用赋形剂的性质。对于无定型样品，崩塌温度（Collapse temperature）Tc通常比Tg'（玻璃转化温度）高约2°C，对于结晶性样品，Tc则等于共晶点温度（Teu，Eutectic temperature）。在结晶性样品和无定型样品的混合物中（结晶性样品占多数），如果产品温度高于Tg'，则无定型相会塌陷，当产品温度在Tg'和Teu之间，无定型相塌陷附着于结晶相的表面，而结晶相提供了机械支撑，不会发生宏观的崩塌。因此，在以晶相为主的非晶相和晶相的混合物中，Tc接近Teu。为了生产可接受的冷冻干燥产品，产品温度需要在低于Tc。 稳定性问题对于蛋白质药物尤其重要。蛋白质对冷冻干燥所产生的应力较为敏感，在此过程中容易降解或分解。冷冻干燥的低温不能保证蛋白质的稳定性，因为许多蛋白质会经历冷变性或在界面处（蛋白质-空气和蛋白质-冰）变性。幸运的是，如果冻干过程蛋白质变性进行的足够缓慢，以至于在明显变性之前干燥已经结束，则意味着可以在远高于Tg'的温度下安全干燥蛋白质，从而可以更快地进行干燥。通常，最佳的冷冻干燥过程是能够以最低的成本获得最高的药物质量，这需要对冷冻干燥的所有可控阶段进行优化。 本文旨在为冻干流程设计和优化提供建议。 冻干的三个阶段 典型的冻干过程包括三个阶段。即预冻，一次干燥和二次干燥。预冻是有效的冻干步骤，其中大多数溶剂（通常是水）与溶质分离形成冰。随着冻结的进行，溶质相变得高度浓缩，被称为“冷冻浓缩”。到冷冻结束时，冷冻浓缩物通常只含20%的水，或者说含有结冰前溶液总水量的1%。冷冻阶段通常需要几个小时才能完成。 当腔室压力降低且隔板温度升高以提供冰升华所需热量时，即开始进行一次干燥。在一次干燥过程中，腔室压力远低于冰的蒸气压，冰通过升华和结晶从产品转移到冷凝器中，并结晶到冷凝器中的冷盘管/板（<-50°C）上。通常，一次干燥阶段是冷冻干燥的最长阶段，此阶段的优化对过程经济性有很大影响。 二次干燥是通常在高温和低压条件下，将冷冻浓缩物中水去除的阶段。甚至在一次干燥的最开始就发生了一些二次干燥，但是二次干燥的大部分发生在一次干燥结束并且产品温度升高之后。二次干燥通常只需要几个小时，而且通过工艺优化减少时间的机会是有限的。通过对冻干的三个阶段进行优化可以获得最佳的冻干工艺。 预冻 预冻是冷冻干燥过程的第一阶段，是将大部分水从药物和赋形剂中分离的阶段，体系分离成多个相，并且在冰和药物相之间形成界面。预冻通常会产生许多不稳定的因素，尤其是对于蛋白质药物而言。这些因素包括增加蛋白质浓度以增强蛋白质分子之间的相互作用从而导致聚集、缓冲盐结晶引起的pH值变化、从蛋白质相中去除大量水而形成的“脱水”效应引起的疏水相互作用降低、较大的冰水界面、大大提高离子强度。众所周知，冰水界面的引入和pH的变化会引起蛋白质稳定性问题。可以通过选择最佳的缓冲盐（即避免使用磷酸盐，琥珀酸盐和酒石酸盐）或将缓冲液浓度降低至几mM来最大程度地降低冷冻过程中的pH值变化。通过增加蛋白质浓度（即“饱和”蛋白质-冰界面）和/或使用表面活性剂，可以最大程度地减少冰-水界面处的蛋白质降解。对于给定的蛋白质配方，工艺设计在蛋白质稳定化方面也起着非常重要的作用。 冷却速率 通过减少过冷度，可使冰表面积最小化，从而使预冻过程中样品更稳定。在实际结晶过程中，实际结晶温度总是低于热力学理论结晶温度，这种现象称为过冷现象，实际结晶温度和理论结晶温度的差值被称为过冷度，过冷度（比如10至25°C）会随冷却速率和其他因素而变化。较高的过冷度导致更多/更小的冰晶和更大的冰比表面积。不同的冷冻方法，例如液氮冷冻，将西林瓶装载到已预冷的隔板上或置于未预冷的隔板上然后逐渐降温，会产生不同的过冷效果，通常液氮冷冻的过冷度最高，而采用预冷隔板的方法过冷度最低 。据报道，以0.5℃/ min降温的方式比隔板预冷的方式产生更大的过冷效果。但是，预冷隔板的方式使各西林瓶的过冷度差异性较大。通常，通过改变预冻时冷却速度来控制过冷度是不切实际的，因为冻干机的冷却速度通常在2°C/min以下，而过冷的程度不太可能在这么小的范围内变化。缓慢冷冻有可能增加易于相分离系统中蛋白质的破坏程度，因为相分离是一个动力学过程，而慢冻并为该过程提供了足够的时间。如果相分离引起蛋白质和稳定剂分离，则稳定剂作用将丧失。当聚合物用作稳定剂时，相分离是最常见的。缓慢冷冻还延长了蛋白质在浓缩液状态下存在的时间，在浓缩状态下生物分子降解速度加快。我们发现适当的冷却速度（约1°C / min）是一个很好的折衷方案，如此可产生适度的过冷度，并具有适度的冰表面积和相当快的冷冻速度，这通常最适合于易于相分离的配方以及不存在相分离的配方。它也（通常）在给定的小瓶内以及从小瓶到小瓶都产生均匀的冰结构。 冻结温度和时间 预冻后，制剂变为固态：也就是说，如果是药物相是无定型状态，则温度需低于Tg'；如果药物相为结晶态，则温度应低于Teu。此条件要求将隔板温度设置为低于Tg'或Teu，且必须将样品保持足够长时间，以使所有溶液都转变为固体。由于西林瓶和隔板之间的导热性有限，因此完全冻结需要较长时间。预冻时间取决于西林瓶的装量，也就是说，较大的装量需要更长的时间才能完全冻结。通常，如果Tg'或Teu高于-38°C，则我们将隔板温度设定为−40°C；其他情况下，通常将隔板的温度设定低于Tg'或Teu 2°C，并留出足够时间以使完全冻结。如果西林瓶装量高度小于或等于1cm，则保温1小时；如果高度大于1厘米，则将保温2小时。可能的话，应避免装量高度大于2 cm，但如有必要，应适当增加冻结时间。 退火 退火是将样品在高于预冻温度下保持一段时间，以使预冻阶段使制剂中的潜在结晶成分（通常是结晶性填充剂）结晶。为了使结晶性填充剂例如甘露醇或甘氨酸有效结晶，常常需要退火步骤。未能使填充剂结晶可能会降低Tg'，而在储存过程中未结晶性填充剂重新结晶使得药物稳定性降低。如果填充剂在一次干燥过程中结晶，可能会导致西林瓶破裂。退火可以促进结晶的完成。退火温度应在无定型相的Tg'和填充剂的Teu之间，以实现高结晶速率和完全结晶。完成结晶需要足够的退火时间。最佳时间取决于所用填充剂的比例和性能。高填充剂与其他溶质的质量比（> 80％的总溶质，建议）比低比率（<50％的总溶质，不推荐）结晶快得多。较低的退火温度可使结晶度提高，因为在低温下过饱和度较高，但是由于此时样品粘度高，结晶速率可能太低。最佳退火条件是结晶度和结晶速率之间的折衷。对于甘露醇或甘氨酸，如果装量高度为1 cm或更大，建议温度为-20或-25°C，退火时间为2 h或更长时间。可以使用冷冻溶液X射线衍射或DSC方法研究退火条件，以评估结晶度的发展。 退火可使样品中结晶度提高，降低样品对水蒸气流动的阻力，从而缩短一次干燥时间。而且，产品的比表面积减小，这降低了二次干燥过程中水分去除的速率，可能导致最终样品中残留水分含量增加或需要更长的二次干燥时间。 建议采用如下预冻方式： 无定型样品： 1.将西林瓶置于隔板上，使其达到5°C； 保持15至30分钟 2.冷却至-5°C（未有结冰现象），并保持15至30分钟（这通常会提高小瓶内和小瓶间结晶的均质性）。 3.以大约1°C / min的速度将搁板温度降低至-40°C（所有溶质均为固态）。 4.如果装量高度小于或等于1cm，则保持1小时；如果装量高度大于1cm，则保持2小时。 通过热循环（退火）实现溶质结晶（结晶药物或填充剂） 1.如上述步骤1至3。 2.将产品温度提高到Tg以上 10至20°C，但远低于共晶点温度，并保持几个小时。 3.步骤3和4如上述无定型样品预冻过程。 一次干燥 冷冻干燥工艺设计的下一步是优化产品温度（Tp）。产品温度取决于制剂的特性，冻干机搁板温度和腔室压力，在一次干燥期间无法直接控制。因此，即使已知其Tc和Tg'，也难以优化给定药物制剂的冻干过程。因一次干燥在冻干时长占比最大，因此优化此部分过程会产生重大的经济效益。即使拥有高技能的开发科学家，优化一次干燥也可能需要进行大量耗时的实验研究。因此，许多制剂在远非最佳的条件下冷冻干燥。未优化的冷冻干燥过程可能会极大地增加过程时间，并可能危及产品质量和/或产生监管问题。一次干燥的原理是选择最佳的目标产品温度（Tp），使产品快速达到目标产品温度，并在整个一次干燥中将产品温度大致保持在目标温度下。 目标产品温度 产品温度应始终低于Tc几度，以获得外观可接受的干燥产品。Tp和Tc之间的温差称为温度安全阈值。众所周知，较高的产品温度会使冻干过程加快，产品温度每升高1°C，一次干燥时间就会减少约13％。因此，优化的冻干过程会在产品温度尽可能高的情况下进行。换句话说，目标产品温度应尽可能接近Tc。但是，如果产品温度太接近Tc，坍塌的风险就很高。因此，最佳目标产品温度是安全性和冻干时长之间的折衷。我们建议，如果冷冻干燥时间较长（例如，超过2天），则应使用较小的安全阈值（2°C）；如果冷冻干燥时间较短（<10h），则应使用较大的安全阈值（5°C），如果初步干燥时间在2天到10小时之间，则应使3°C作为安全阈值。通常，Tp不应高于-15°C，否者易出现冻干机传热和传质能力的超负荷现象， 使得冻干机腔室压力失控且产品温度超过目标值。 冻干机压力 一次干燥在低压下进行，以提高冰的升华速率。腔室压力（Pc）影响传热和传质，是冷冻干燥工艺设计的重要参数。Pc应远低于目标产品温度下的冰蒸气压力，以实现较高的升华速率。升华速率是单位时间（小时）内升华的冰块质量（g），可用如下等式表示： 图片 其中，dm/dt是冰的升华速率（每小瓶克/小时），Pice是在升华界面温度下冰的平衡蒸气压（Torr），Rp和Rs分别是冻干过程中的干层和塞子对升华界面蒸汽传输的阻力（Torr·h / g）。 升华速率与冰的蒸气压和腔室中水的分压（Pi）之间的压力差成正比，该差是冰升华的驱动力。Pi与初次干燥时的腔室压力（Pc）基本相同。在给定的产品温度（即给定的冰蒸气压力）下，最小的腔室压力可提供最高的冰升华速率。然而，非常低的腔室压力可能会引起问题，例如产品被挥发性塞子成分或泵油污染，并且在传热中还会产生较大的异质性，从而在小瓶之间产生较大的产品温度异质性。在大多数实际应用中，腔室压力在50至200 mTorr之间变化。很难将腔室压力始终保持在远低于50 mTorrr的水平，几乎没有理由使用远高于200mTorr的压力。据报道，适中的腔室压力（100–150 mTorr）可在一组样品瓶中实现最佳的热传递均匀性。因此，最佳腔室压力是高升华率和均匀传热之间的折衷。 可用如下公式选择已知目标产品温度（Tp）下的“最佳”腔室压力。 图片 其中Pc是腔室压力（Torr），Tp是产品温度（°C） 达到目标产品温度所需的隔板温度 冻干过程设计中最耗时的部分是确定隔板温度。一次干燥过程中的产品温度通常比搁板温度低5至40°C，并随腔室压力、搁板温度、容器（通常是小瓶）的传热系数、制剂的受热历史（甚至使用冷冻干燥器）而变化。在恒定的腔室压力和搁板温度下，产品温度会随着干燥的进行而变化，从初次干燥的开始到结束通常会升高1至3°C。产品温度可以通过几种方法进行测量，包括热电偶温度传感器，以及温度的动压测量技术（MTM）。MTM是一种程序，可通过在短时间内快速将冷冻干燥室与冷凝器隔断并在随后的这段时间内通过拟合理论值来分析升压界面，从而在一次干燥过程中测量升华界面处的产品温度与MTM方程之间的关系。热电偶方法测量样品瓶底部的产品温度，而MTM方法测量冰升华界面的产品温度，该温度通常比样品瓶底部的温度低0.5至2°C。MTM方法的优点是在冷冻干燥过程的设置过程中最少的人工干预（即无需操作员将温度传感器手动放置在样品瓶中）。 粗略地讲，隔板温度没变化1-2℃，产品温度会变化5℃。因带有热电偶探头的产品一次干燥时长较短，当产品温度达到目标温度时，应当再延长一次干燥时长的三分之一时间，使所有的产品均完成一次干燥。 一次干燥终点确定 一次干燥的终点可以通过几种不同的方法来确定。在一次干燥结束时，小瓶中没有冰的存在(即没有冰的升华和升华的热量去除)，因此，产品温度上升到隔板温度，冻干室中的蒸汽成分大部分是水蒸汽变为大部分是空气或氮气。(1)因此，当产品温度接近隔板温度时，表示一次干燥的终点。通常，产品温度作为时间的函数在一次干燥结束时显示出温度的陡峭上升，然后是一个平台。通常情况下，由于冷冻行为的偏差，装有热电偶的小瓶不能代表整个批次。热电偶小瓶通常具有较少的过冷量、较大的冰晶和较快的冰升华，因此，一次干燥时间较短。热电偶小瓶和其他批次之间的干燥差异可能是一个严重的问题，特别是对于生产型设备来说。另外，在生产中，为了最大限度地保证无菌性，热电偶通常放在前排小瓶中。由于非典型的辐射传热效应，前排小瓶比内瓶更早完成一次干燥。因此，热电偶小瓶不具有代表性。如果采用产品温度作为终点的判断依据，则需要额外增加一次干燥的时间。在其他可以使用的方法中，那些能够感知室内气体成分从水蒸气到氮气的转变的方法也许是最容易使用的。(2)露点传感器，可以检测蒸汽成分的变化或冻干室中的相对湿度，由于室中的蒸汽成分从几乎100%的水蒸气变为基本100%的氮气，在一次干燥结束时，露点会急剧下降。（3）压力升试验也是一种有效的判断终点的方法。 二次干燥 升温速率和腔室压力 二次干燥的隔板温度应缓慢上升，因为快速的温度上升可能会导致无定形产品的塌陷。由于在二次干燥早期，非晶产品的残余水分含量相当高，因而玻璃化转变温度较低，因此在二次干燥早期，塌陷的可能性最大。对于非晶产品来说，0.1或0.15℃/min的升温速度一般是安全和合适的程序，但一旦产品温度达到环境温度，这种缓慢的升温速度就不必维持了。结晶型产品在二次干燥过程中没有任何塌陷的可能，对于这类产品建议采用较高的升温速率（0.3或0.4℃/min）。二次干燥时，腔室压力小于200mTorr的情况下，水的解吸率与室压关系不大，所以二次干燥时不必改变室压。 隔板温度和二次干燥时长 产品应在 "高 "温度下保存一段时间，以使水分充分解吸。通常情况下，短时间运行高隔板温度比长时间运行低温更好。原因是在给定的温度下，水分解吸率随着时间的推移而急剧下降，在给定温度下超过3-6小时的时间对进一步降低水分含量作用不大。无定形产品比结晶产品更难干燥，因此，需要更高的温度和更长的时间来去除水分。二次干燥条件还取决于溶质浓度。在溶质浓度较高的情况下（即溶液中固体含量>10%），干燥后的产品比面积较小，更难去除吸收的水分，因此需要更长的时间和/或更高的温度来完成二次干燥。通常情况下，在终点温度下干燥时间为3-6小时为最佳，终点温度根据配方的不同而相应变化，但通常在40-50℃范围内，即使是蛋白质也是如此。最佳的二次干燥时间可以通过在不中断冷冻干燥的情况下从冷冻干燥器中提取样品，并使用卡尔-费舍尔滴定法(KF)、热重分析法(TGA)或近红外光谱法测量其水分含量从而确定干燥终点。众所周知，高含水量通常会降低药物的储存稳定性。因此，通常将产品冷冻干燥至非常低的残留水分含量（约0.5%）。然而，冻干产品的低水分含量并不能保证最佳的储存稳定性，至少对于蛋白质和更复杂的生物制品来说是如此。在极少数情况下，有一个中间水分含量，产品具有最佳的储存稳定性。如果目标水分含量是一个中间水平，二次干燥的设计就比较困难。通常，长干燥时间(6h)和低货架温度(约0℃)的组合是最好的，但具体条件必须通过试验来确定。 |
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