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小小书虫飞

新虫 (小有名气)

[交流] 核酸检测实验中如何防范气溶胶污染已有3人参与

科研和临床检验场所PCR分子实验使用频率较高,PCR实验怕出问题了,当PCR出现假阳性的时候,我们常常会考虑是不是引物、试剂、Mix、模板、水等发生了污染,然后逐一排查,有时还是找不到原因,耗时耗力。

那么这些试剂和仪器到底为什么会被污染了呢? 其实有很大因素是核酸气溶胶污染。

1、核酸检测实验需注意核酸气溶胶污染

核酸检验人都知道在核酸检测实验室内样本的制备、扩增过程中都会产生各种污染,比如样本交叉污染、试剂仪器交叉污染、克隆质粒污染、PCR扩增产物污染、还有极容易忽视的气溶胶污染,气溶胶是由固体或液体小质点分散并悬浮在气体介质中形成的胶体分散体系,在空气与液体面摩擦时,比如在核酸提取制备模板时,反复吹吸/混匀震荡反应液,以及PCR体系配液时充分震荡反应管,开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝,因而由其造成的污染是一个非常重要而被忽视的污染源。

DNA/RNA气溶胶污染的问题,很严重,广泛分布在样本容器、实验室台面,试剂溶液中、仪器表面、内管附着等等,极其微量的气溶胶污染即可造成假阳性的结果,进而可能引起整个PCR实验室的污染,严重的甚至要关闭实验室,严重影响实验工作,甚至耽误疫情防控工作的开展。

2、实验室为何会出现气溶胶?

在核酸检测实验过程中,高速运转离心时未盖紧试管盖;
手工提取核酸时剧烈地摇动反应管;
短时间处理大量的样本核酸提取实验;
PCR扩增完成后开盖;
吸样时及移液器的反复吸样;
处理血液样本时,标本暴漏在实验室空气中。
以上举例部分的这些行为都会使空气与液体表面摩擦,产生核酸气溶胶, 这些核酸小液滴还会落到实验台面、PCR仪、移液枪、吸头、盒子、检测人员衣服、头发、门把手等等地方,如果我们不注意,这些核酸气溶胶就会日积月累地积聚,这样做检测实验就特别出现问题比如PCR假阳性或者像报道中的造成检测人员的感染。大面积核酸气溶胶污染非常难以清除,若不采取清理与预防措施,污染会更加严重,长期释放污染核酸,终会不仅导致实验室停工也会导致检测人员的健康问题,所以对于核酸气溶胶污染一定要给予重视。

3、如何避免产生气溶胶污染呢?

第一:自我防护是关键,相对于一线的医生,检测人员的防护服、口罩、防护镜等一个也不能少;《新型冠状病毒实验室生物安全指南》中就指出病毒抗原检测、血清学检测、核酸提取、生化分析,以及临床样本的灭活等操作,应当在生物安全二级实验室进行,同时采用生物安全三级实验室的个人防护。

第二:每次检测实验前后,都要使用专业的核酸气溶胶污染清洁剂,对检测台面、核酸提取仪、PCR仪、手持移液器、离心机、振荡器、空气、门把手、地面、墙壁等位置进行彻底清楚残核酸留气溶胶和潜在污染源,保证检测样本的准确性和检测人员的安全性。

第三:加强气溶胶污染的监测工作。通过专业监测试剂盒对医疗场所和检测场所都进行定期监控,做好防护,一旦发现医疗场所检测出阳性样本,应及时暂定场所的使用,对过消毒、气溶胶清除等措施,尽可能防止病毒通过场所间接扩散;据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝,因而由其造成的污染是一个非常重要而被忽视的污染源。气溶胶污染广泛分布在样本容器、实验室台面,试剂溶液中、仪器表面、内管附着等等,极其微量的气溶胶污染即可造成检测样本假阳性的结果,进而可能引起整个PCR实验室的污染,严重的甚至要关闭实验室,严重影响疫情的诊断和防治工作,所以说污染监测刻不容缓。

除采取上述措施之外,新冠核酸检测实验室还应该使用无菌滤芯吸头、无菌离心管等耗材,尽量减少实验环节的意外因素,减少核酸检测实验产生的气溶胶、液体飞溅等造成的实验仪器、移液器等污染,而影响结果的判读。如有因操作失误或意外引起的实验室生物安全,还需参考《新型冠状病毒实验室生物安全指南》中相关措施进行处理:

(一)新型冠状病毒毒株或其他潜在感染性材料污染生物安全柜的操作台造成局限污染:使用有效氯含量为0.55%消毒液,消毒液需要现用现配,24小时内使用。此后内容中有效氯含量参照此浓度。

(二)含病毒培养器皿碎裂或倾覆造成实验室污染:保持实验室空间密闭,避免污染物扩散,使用0.55%有效氯消毒液的毛巾覆盖污染区。必要时(大量溢撒时)可用过氧乙酸加热熏蒸实验室,剂量为2g/m3,熏蒸过夜;或20g/L过氧乙酸消毒液用气溶胶喷雾器喷雾,用量8ml/m3,作用1~2小时;必要时或用高锰酸钾-甲醛熏蒸:高锰酸钾8g/m3,放入耐热耐腐蚀容器(陶罐或玻璃容器),后加入甲醛(40%)10ml/m3,熏蒸4小时以上。熏蒸时室内湿度60%-80%。

(三)清理污染物严格遵循活病毒生物安全操作要求,采用压力蒸汽灭菌处理,并进行实验室换气等,防止次生危害。(转自先达基因-gendx.cn)
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2楼2021-01-14 11:35:12
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黄铁柱姐姐

新虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
楼主,想问个问题,PCR扩增时总是连阴性对照都是阳性的结果,但水,引物,模板都是没问题的,问题就是MIX,普通蓝色的mix总是有假阳性(换了新的也不行),但换了做荧光定量的mix结果就好着,这是啥原因呢?求指教!

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3楼2021-01-14 21:06:26
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junjieshao

铜虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by 黄铁柱姐姐 at 2021-01-14 07:06:26
楼主,想问个问题,PCR扩增时总是连阴性对照都是阳性的结果,但水,引物,模板都是没问题的,问题就是MIX,普通蓝色的mix总是有假阳性(换了新的也不行),但换了做荧光定量的mix结果就好着,这是啥原因呢?求指教! ...

你扩增的是什么基因,是不是大肠杆菌的基因?
taq也是从大肠菌里纯化出来的,那个普通的mix里面可能有残留的大肠杆菌基因。
那个萤光mix可能更纯,没有污染,或者菌种不同。
4楼2021-01-16 04:20:14
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