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【调剂】北京石油化工学院2024年16个专业接受调剂
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yuanyuanwen

铜虫 (小有名气)

[求助] 如何提取胞内cAMP？！！求求各位大神帮帮我已有1人参与

        是这样子的，楼主目前在做一个药物的测活，给药刺激细胞后，检测细胞产生的cAMP,用的是RD公司的试剂盒，这个试剂盒有一个步骤就是在检测前需要提取细胞内的cAMP,但是根据试剂盒说明书上写得，用预冷的PBS洗涤细胞三次后，重悬细胞至试剂盒所提供的细胞裂解液中，反复冻融细胞使得裂解全完，再离心去除细胞碎片，提取上清液进行检测。
        但是楼主做了一次后，发现在加入裂解液至细胞板中，直接放入-20度，冻融一次，吸取裂解液台盼蓝染色后未能发现有细胞碎片。怀疑是裂解液加过量引起细胞全部裂解了，然后吸取裂解离心后直接取上清进行检测。结果是给药刺激组与空白组的OD值一样。
         所以想问各位，我是否是根本没有裂解细胞？由于cAMP保护剂是在药液中，在裂解前是经过洗涤了，是否因为保护剂洗掉之后，样品中所含的cAMP降解导致未能检测出cAMP的含量。或者大家有没有更好的提取胞内cAMP的方法分享给楼主，感激不尽！！！
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星辰陨落无所降，让我搭个顺风车，越过夕阳。
1楼2020-11-21 12:33:34
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yuanyuanwen

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2020-11-21 13:20:17
细胞内小分子提取一般用的是强酸或强碱裂解细胞，然后再中和。这样可以除去细胞内的大部分蛋白质和核酸，减少干扰。即便用冻融裂解细胞的方法，往往也都包括一步加热失活的步骤。建议楼主一字一句地仔细阅读试剂盒说 ...

您好，我想请问如果我直接加入裂解液至细胞板中，冷冻后再加热使溶解，是否能裂解细胞？
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星辰陨落无所降，让我搭个顺风车，越过夕阳。
3楼2020-11-21 13:54:59
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
yuanyuanwen: 金币+30 2020-11-26 12:51:30
细胞内小分子提取一般用的是强酸或强碱裂解细胞，然后再中和。这样可以除去细胞内的大部分蛋白质和核酸，减少干扰。即便用冻融裂解细胞的方法，往往也都包括一步加热失活的步骤。建议楼主一字一句地仔细阅读试剂盒说明书。
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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
2楼2020-11-21 13:20:17
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人
引用回帖:
3楼: Originally posted by yuanyuanwen at 2020-11-21 13:54:59
您好，我想请问如果我直接加入裂解液至细胞板中，冷冻后再加热使溶解，是否能裂解细胞？...

快速冻融可以裂解细胞，但裂解能力较差。很多裂解液里有TritonX-100等洗涤剂，可以破坏细胞膜，因此能大大提高裂解能力。
如果担心Triton X-100会影响后续实验，可以重复三次玻璃砂震荡配合液氮快速冻融，用物理方法裂解细胞。
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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
4楼2020-11-21 14:48:45
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yuanyuanwen

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2020-11-21 14:48:45
快速冻融可以裂解细胞，但裂解能力较差。很多裂解液里有TritonX-100等洗涤剂，可以破坏细胞膜，因此能大大提高裂解能力。
如果担心Triton X-100会影响后续实验，可以重复三次玻璃砂震荡配合液氮快速冻融，用物理方 ...

好的 谢谢您

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星辰陨落无所降，让我搭个顺风车，越过夕阳。
5楼2020-11-21 16:46:13
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