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yuanyuanwen

铜虫 (小有名气)

[求助] 如何提取胞内cAMP?!!求求各位大神帮帮我已有1人参与

        是这样子的,楼主目前在做一个药物的测活,给药刺激细胞后,检测细胞产生的cAMP,用的是RD公司的试剂盒,这个试剂盒有一个步骤就是在检测前需要提取细胞内的cAMP,但是根据试剂盒说明书上写得,用预冷的PBS洗涤细胞三次后,重悬细胞至试剂盒所提供的细胞裂解液中,反复冻融细胞使得裂解全完,再离心去除细胞碎片,提取上清液进行检测。
        但是楼主做了一次后,发现在加入裂解液至细胞板中,直接放入-20度,冻融一次,吸取裂解液台盼蓝染色后未能发现有细胞碎片。怀疑是裂解液加过量引起细胞全部裂解了,然后吸取裂解离心后直接取上清进行检测。结果是给药刺激组与空白组的OD值一样。
         所以想问各位,我是否是根本没有裂解细胞?由于cAMP保护剂是在药液中,在裂解前是经过洗涤了,是否因为保护剂洗掉之后,样品中所含的cAMP降解导致未能检测出cAMP的含量。或者大家有没有更好的提取胞内cAMP的方法分享给楼主,感激不尽!!!
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fuyuandj86

实习版主 (正式写手)

己所不欲,勿施于人

【答案】应助回帖

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感谢参与,应助指数 +1
yuanyuanwen: 金币+30 2020-11-26 12:51:30
细胞内小分子提取一般用的是强酸或强碱裂解细胞,然后再中和。这样可以除去细胞内的大部分蛋白质和核酸,减少干扰。即便用冻融裂解细胞的方法,往往也都包括一步加热失活的步骤。建议楼主一字一句地仔细阅读试剂盒说明书。
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业精于勤,荒于嬉;行成于思, 毁于随
2楼2020-11-21 13:20:17
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yuanyuanwen

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2020-11-21 13:20:17
细胞内小分子提取一般用的是强酸或强碱裂解细胞,然后再中和。这样可以除去细胞内的大部分蛋白质和核酸,减少干扰。即便用冻融裂解细胞的方法,往往也都包括一步加热失活的步骤。建议楼主一字一句地仔细阅读试剂盒说 ...

您好,我想请问如果我直接加入裂解液至细胞板中,冷冻后再加热使溶解,是否能裂解细胞?
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3楼2020-11-21 13:54:59
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fuyuandj86

实习版主 (正式写手)

己所不欲,勿施于人

引用回帖:
3楼: Originally posted by yuanyuanwen at 2020-11-21 13:54:59
您好,我想请问如果我直接加入裂解液至细胞板中,冷冻后再加热使溶解,是否能裂解细胞?...

快速冻融可以裂解细胞,但裂解能力较差。很多裂解液里有TritonX-100等洗涤剂,可以破坏细胞膜,因此能大大提高裂解能力。
如果担心Triton X-100会影响后续实验,可以重复三次玻璃砂震荡配合液氮快速冻融,用物理方法裂解细胞。
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4楼2020-11-21 14:48:45
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yuanyuanwen

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2020-11-21 14:48:45
快速冻融可以裂解细胞,但裂解能力较差。很多裂解液里有TritonX-100等洗涤剂,可以破坏细胞膜,因此能大大提高裂解能力。
如果担心Triton X-100会影响后续实验,可以重复三次玻璃砂震荡配合液氮快速冻融,用物理方 ...

好的 谢谢您

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5楼2020-11-21 16:46:13
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