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离子交换色谱
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离子交换层析填料由球形颗粒组成，表面由带有正电荷或负电荷的离子基团所取代。填料通常是多孔的，从而可具有更多的内表面积。将填料装入柱中形成分离柱床，之后将装填好的柱子利用蛋白纯化仪UEV 25D用缓冲液对柱床进行平衡，使缓冲液进入填料的孔道以及颗粒之间的空间。 平衡缓冲液要选择适当的pH值和离子强度，以保证目的蛋白能够结合在填料上而杂质尽量不结合。结合的蛋白将会被有效的富集在离子交换柱上，而不具有正确表面净电荷的蛋白则会在加载后与缓冲液以相同的速度穿过分离柱。 改变缓冲液条件以洗脱结合的目的蛋白。通常情况下，可通过增加缓冲液的离子强度（盐浓度），或者有时候会改变pH值来进行洗脱。随着离子强度的增大，盐离子（典型的是钠离子和氯离子）会同结合的组分竞争填料表面的电荷，此时一种或多种结合的成分会被洗脱下来，并移动出分离柱。在选定的pH条件下，具有最高净电荷值的蛋白质会保留时间最长，最后被洗脱下来。蛋白所带的净电荷越多，洗脱时所需要的离子强度就越高。通过使用不同的梯度来改变离子强度，蛋白质可以以纯化浓缩后的形式被洗脱下来。 在洗脱过程末尾，非常高离子强度的冲洗步骤会移除掉几乎所有紧密结合的蛋白。在下一个运行过程对更多蛋白样品进行分离前，应使用初始缓冲液对分离柱进行再平衡。 分辨率 离子交换层析的分辨率由三方面组成：洗脱下来的不同峰的分离程度（填料的选择性），分离柱产生窄而对称峰的能力（柱效），当然还有能应用的样品的量。这些因素会被应用中的一些问题所影响，如填料特性，结合及洗脱的条件，分离柱的装制及流速等。 分辨率Rs的定义为：两个样品峰尖之间的距离与两个峰宽度平均值的比值。Rs可通过色谱图来确定，如下图 当分辨率为1时，假定峰是对称的且大小基本相同，则98%的样品峰可获得98%的纯度。基线分离的分辨率要求Rs≥1.5，在此值时样品峰的纯度为100%。  分辨率.png |
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