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【调剂】北京石油化工学院2024年16个专业接受调剂
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童话zhl

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
10楼: Originally posted by 狗狗狗尾巴草 at 2020-03-27 20:41:47
理论上不要也可以的，但我都会带着...

哦哦，好的，谢谢！

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11楼2020-03-27 20:46:41
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NAIVE.

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 童话zhl at 2020-03-26 11:51:03
我用snapgene软件模拟了一下，上下游位置互换一下，插入的目的片段方向也是相反的，就是不知道哪个方向是对的
...

要看你基因的方向是怎么样的，你基因的方向跟质粒上的转录方向就是启动子方向相同的话那就是你说的第一种情况，如果基因方向相反那就反向设计。

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12楼2020-03-31 23:24:16
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原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

如果你已经确定选择的酶切位点为单克隆位点，那么关于两个酶谁在前，谁在后，你可以看你的质粒图谱里面多克隆位点位置是一个黑色的箭头，这个代表多克隆位点内基因的转录方向，如果你使用的snapgene软件，点开载体序列是可以看到T7启动子，RBS等模块的，而基因的表达也是有方向性的，即从起始密码子ATG到终止密码子的方向（上游-下游），你的目的基因克隆至载体多克隆位点时候，需要将基因的方向和黑色箭头的方向保持一致，也就是起始密码子ATG就是靠近启动子等模块，对于28a载体，显然BamHI是靠近启动子的，所以应该使BamHi连接到你基因的ATG，而HindIII连接在基因的终止密码子末端，这样才可以在启动子处开启蛋白表达时候，与你的基因保持方向一致，不然如果颠倒两者，诱导表达刚开始，遇到的是你基因的终止密码子，或者无法找到正确的ATG阅读框，导致蛋白不表达或者错误表达。
    其实了解清楚基因的转录翻译过程，基本就不会出现错误，特别是在翻译的过程中，核糖体识别RBS后，会往下游寻找最近的三联起始密码子ATG，如果你把你目的基因的ATG放在了后面，而把终止密码子靠近RBS，那么核糖体可能就没办法识别你目的基因的阅读框，或者找到一个错误的起始密码子就开始转录了，得到的也是错误的蛋白。
    关于ATG起始密码子是否需要加上去，个人认为大部分时间都是需要加的，除非你选择的酶切位点含有ATG，和你的基因ATG重复，你可以将两者合并一个，比如常用的NdeI酶（位点是CATATG）,它的末端就是一个起始密码子，如果后面紧接你的基因，你可以把两个ATG合为一个，不然一个阅读框内两个ATG，核糖体优先识别靠前的NdeI的ATG，而你的目的基因的起始密码子这时候就是一个普通的蛋氨酸密码子了，没有起始密码子的作用了，这样翻译出来的氨基酸肽链会多一个蛋氨酸，同理，如果你选择的酶相同阅读框内不含有ATG，而你的基因又没有携带ATG，这样就会无法启动翻译或者启动错误的翻译。
     以上都可以通过snapgene软件检查不同位点选择，获得怎么的氨基酸序列，确定是否是你想要的。当然之上都是根据28a质粒图谱进行的分析，可能其他载体上的限制酶位点会有差异，根据相同的原理，选择合适的酶。
    祝好
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童话zhl
天空才是极限，我有信心飞的更高！
13楼2020-04-08 12:33:50
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童话zhl

新虫 (小有名气)
送红花一朵


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14楼2020-04-08 21:08:52
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童话zhl

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
13楼: Originally posted by 原海亮 at 2020-04-08 12:33:50
如果你已经确定选择的酶切位点为单克隆位点，那么关于两个酶谁在前，谁在后，你可以看你的质粒图谱里面多克隆位点位置是一个黑色的箭头，这个代表多克隆位点内基因的转录方向，如果你使用的snapgene软件，点开载体序 ...

好的，您的解答很详细，非常感谢您！

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15楼2020-04-08 21:09:40
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yfangok

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 原海亮 at 2020-04-08 12:33:50
如果你已经确定选择的酶切位点为单克隆位点，那么关于两个酶谁在前，谁在后，你可以看你的质粒图谱里面多克隆位点位置是一个黑色的箭头，这个代表多克隆位点内基因的转录方向，如果你使用的snapgene软件，点开载体序 ...

你好，请教一个问题，我用的酶是NcoI（酶切位点是CATGCCATGGCATG）这个酶切位点就带了两个ATG，我的基因如果再带个ATG，就会有3个ATG，到底偏向于从哪个ATG开始翻译呢？如果从第一个ATG开始翻译，我的基因就会发生移码。遇到这种情况该怎么办？先谢谢你啊！
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交流学习
16楼2020-10-17 15:13:41
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