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phgmogo新虫 (初入文坛)
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联合体外代谢组学和生理药代动力学建模考察万古霉素引发的肾毒性已有1人参与
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原文献作者 Haiyan Du1, Zheng Li2, Yi Yang3, Xiao Li1, Yongxiang Wei4, Yang Lin1, Xiaomei Zhuang2 杜海燕1, 李正2, 杨毅3, 李骁1, 魏永祥4, 林阳1, 庄笑梅2 1首都医科大学附属北京安贞医院，药事部 2军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所，抗毒药物与毒理学国家重点实验室 3首都医科大学附属北京安贞医院，心脏外科危重症中心 4首都医科大学附属北京安贞医院，耳鼻咽喉头颈外科中心 参考文献 Haiyan Du, Zheng Li, Yi Yang, et al., New insights into the vancomycin-induced nephrotoxicity using in vitro metabolomics combined with physiologically based pharmacokinetic modeling. J Appl Toxicol. 2020: 1–11. IF: 3.065 推荐理由： 本案例搭建与验证万古霉素在大鼠与人体的PBPK模型，并基于模型预测药物在肾脏及肾小管中的浓度变化；并在推测肾脏组织浓度的基础上，设定体外细胞毒性实验考察万古霉素的浓度变化对肾脏细胞的毒性；最后鉴定出一系列可作为生物标记物的溶血磷脂，其体内的释放与万古霉素的浓度具有明显的浓度依赖性。总之，案例联合机制性PBPK模型和体外代谢组学以深入解释万古霉素引发肾毒性的体内外关系；此外该案例对于学习基于PBPK模型的种属外推(预测PK)、由血浆PK推测组织浓度变化、膜限速组织药物的PBPK建模都具有参考意义。 案例摘要： 目的：通过生理药代动力学(PBPK)的建模与模拟，研究万古霉素在人体肾小管及肾脏中的浓度。在研究肾小管中万古霉素暴露量的基础上，通过细胞毒性实验和体外代谢组学分析，考察万古霉素在人肾脏近端小管上皮细胞中的毒性。 所建立的大鼠PBPK模型预测结果和观测值基本吻合，预测万古霉素在肾小管中的浓度是血浆的40-50倍；进一步将该模型外推到人体，预测人体每6小时给药500 mg后在肾小管中的浓度范围为316.1-2136.6 μg/mL、每12小时给药1000 mg后的浓度范围为199.0-3932.5 μg/mL。4 mg/mL 万古霉素的细胞毒性实验也表明其有显著的肾毒性。通过代谢组学发现了11种溶血磷脂酰胆碱和1种溶血磷脂酰乙醇胺，且溶血磷脂的释放与万古霉素 24小时的治疗浓度(0.125-4 mg/mL)具有明显的浓度依赖性。该研究通过机制性PBPK模型讲述了万古霉素在肾脏中的暴露与其临床用药浓度下的肾毒性之间的关系；并鉴定出一系列可作为潜在生物标记物的溶血磷脂。 软件用途： 该案例，利用GastroPlus软件搭建了万古霉素在大鼠及人体的PBPK模型，预测并验证了药物在血浆、肾脏、肾小管中的PK曲线；且可以推测给药剂量、受试者人群(健康人到病人等)等信息变化后，药物在人体内血浆及组织中的浓度随时间的变化。基于所预测的组织浓度，进一步分析与体外细胞毒性实验、代谢组学鉴定潜在的生物标记物等数据间体内外关系，以深入理解万古霉素肾毒性的机理以及体外潜在标记物。 此外，GastroPlus软件还用于准确捕获万古霉素这类组织细胞膜限速型扩散的分布过程。 1. 研究背景 万古霉素（vancomycin）是治疗多药耐药性革兰氏阳性菌引起的侵袭性感染的一线药物，但是由其引发的肾毒性却日益增加，特别是复杂危重的病人。当前，未能很好地阐述万古霉素引起的肾毒性与其作用部位的暴露量之间的联系。尽管先前的一些研究透露了肾小管细胞的促炎性氧化、线粒体功能障碍和细胞凋亡涉及万古霉素引发的急性肾损伤(AKI)，但是依然不清楚肾毒性的真正机理。此外，临床用药中也很少有敏感、可靠的生物标记物以指示万古霉素的肾毒性；常规的方式建议监测万古霉素的谷浓度以确保患者的用药安全，但这并没有显著改善万古霉素临床肾毒性与死亡率的发生。 一些研究建立在组织解剖学的基础上，指出万古霉素临床剂量下的暴露与其发生急性肾损伤AKI的相互关系。虽然这些研究暂未被充分认定，但组织暴露还是认为药物产生药效及毒性的重要环节，因为通常药效及毒性靶标很少位于血浆中。可是，临床中很难测定人体的组织浓度变化。生理药代动力学(PBPK)模型由机体的不同组织器官，并连接机体血液循环构建起来。PBPK模型可以机制性地阐述一个化合物的处置过程，现已广泛地用于预测人体PK和药物药物相互作用，此外还能够很好地描述组织处置特征。 该工作的目的是为了揭示万古霉素肾毒性的特性与其在肾小管中浓度之间的关系。首先搭建了大鼠的PBPK模型，以探索万古霉素在肾小管中的暴露与血浆浓度间的关系；然后将大鼠PBPK模型外推到健康人体，以预测肾小管中的万古霉素浓度；最后通过监测的血浆谷浓度数据，对ICU中中等到重度肾损伤病人的PBPK模型进行了验证。基于PBPK模型推测的肾小管浓度水平，在肾脏近端小官上皮细胞株(HKCs)开展体外毒性评估以及代谢组学分析；从而进一步探索万古霉素引发的肾毒性机理以及表征肾毒性的生物标记物。 2. 建模数据与处理 2.1 万古霉素的相关建模参数 万古霉素基础PBPK模型输入的理化性质参数，见表1 2.2 数据获取及处理 为了预测万古霉素的PK曲线及组织分布，整个PBPK模型分为以下四个步骤：(a)构建大鼠PK及组织分布的基础PBPK模型；(b)将大鼠PBPK模型外推到人体，以预测和验证万古霉素在美国年轻人血浆PK和尿液排泄行为；(c)采用GastroPlus内建的美国健康成人在不同剂量、多次给药，以及心外科手术后伴随肾功能损伤病人的PK行为对模型进一步验证；(d)预测临床监测中无法获得的健康人或肾损病人的肾脏及肾小管中万古霉素分布。 由于万古霉素经常是以静脉(iv)的形式给药，因此组织分布和药物清除的表征是搭建该药物PBPK模型的两个重要环节。万古霉素具有中等脂溶性、分子体积大以及众多非离子基团，因此预期万古霉素的组织分布是膜限速的特征，其中细胞膜渗透能力与表面积的乘积(PStc)是该表征该类型组织分布的一个重要参数。案例假设不同组织器官的细胞膜组成是相近的，通过大鼠观测的血浆及肾脏暴露优化得到特定的PStc数据为4 × 10−5 mL/s/mL cell volume，并用此参数转化计算每个组织实际的PStc； 已经有大量研究表明万古霉素主要经肾脏排泄的方式清除：总清除的90%为肾脏原型排泄，剩下10%大概为肝脏代谢清除。模型中通过血浆游离药物分数(fup)与肾小球滤过率(GFR)的乘积定义万古霉素的肾脏清除；也加入10%的肾脏清除作为肝脏代谢清除率；除此之外，没有纳入其它的清除机制。模型中未考虑主动转运，仅考虑肾小球滤过及细胞膜简单被动扩散对万古霉素组织分布及肾脏清除的贡献； 按照大鼠相似的特性进行设置并选择相同的膜限速组织以及PStc数值，外推至人体PBPK模型，以预测单剂量和多剂量给药后万古霉素在人体血浆、肾脏和肾小管中的浓度变化。模型也进一步采用临床心外科手术后患者给药后的血浆谷浓度数据进行验证，并预测患者肾脏及肾小管中的浓度。以急性肾损伤AKI指标划分的临床患者，提示其肾功能可能已经变得很差，因此患者模型中选择了GastroPlus内建不同等级的肾损伤病人(因为软件目前主要以GFR的降低来划分不同程度的肾损)。 2.3 细胞毒性的分析 在预测得到多次给药后，万古霉素在肾小管中的分布及浓度变化基础行，设计了一系列浓度范围的万古霉素以考察其对肾脏近端小官上皮细胞株HKCs的毒性。在不同浓度万古霉素或阴性对照暴露于肾脏近端小官上皮细胞株HKCs体系24小时后，采用XTT试剂盒评估细胞的活性，以考察万古霉素对HKCs的毒性特征。 2.4 代谢组学分析 为了发现特异性的代谢产物以用作表征万古霉素引发肾毒性的选择性和敏感性的生物标记物，进一步研究了细胞培养液的代谢曲线；在上述细胞毒性实验的上清液中进行了代谢组学的分析。 3. 模型结果与分析 3.1 大鼠PBPK模型的搭建与验证 基于膜限速型组织的假设，并通过匹配大鼠血浆及肾脏的浓度-时间曲线优化了PStc数值。预测得到的大鼠单剂量10 mg/Kg给药后的PK曲线与观测结果较为一致，血浆AUC的数值与观测结果的误差(P/O)控制在1.5倍以内，预测结果如下图1： 单剂量10 mg/Kg静脉推注给药后，大鼠实测及PBPK模型预测的浓度-时间曲线图(深蓝色方块点与连续曲线表示大鼠血浆观测及预测的血浆浓度-时间数据；绿色方块点与连续曲线表示大鼠肾脏观测及预测的浓度-时间数据) 3.2 万古霉素种属外推及人体PK预测 将大鼠的PBPK模型外推到人，预测美国年轻人单剂量给药后的浓度变化，以及美国成人多次给药(不同剂量)后的PK曲线，结果见下图所示，相关的PK参数统计结果见下表。模拟的人体血浆PK参数与观测值相比也在误差允许范围内(0.7-1.5)。此外，单剂量给药后的美国年轻人还采集了尿液排泄数据，从模型中可以看到预测的尿液排泄曲线能够很好地吻合观测数据(P/O=0.99)。PK参数统计表中的数据显示PK参数的P/O位于0.79-1.05之间，说明建立的PBPK模型能够很准确地预测万古霉素多次给药后血浆中浓度-时间的变化(该剂量方案也常用在临床实践中)。此外，建立和评估了该模型对中国人给药后的预测能力，统计结果也依然表明P/O在可接受的范围内。见图2 单剂量1000 mg静脉滴注给药后，美国年轻人实测及PBPK模型预测的浓度-时间曲线图(深蓝色方块点与连续曲线表示人体血浆观测及预测的血浆浓度-时间数据；绿色方块点与连续曲线表示人累积尿排泄的观测及预测的万古霉素含量-时间数据) 多剂量静脉滴注给药后，美国成人实测及PBPK模型预测的血浆、肾脏、肾小管浓度-时间曲线图(深蓝色、浅蓝色及绿色连续曲线分别表示预测的人体血浆、肾脏和肾小管平均浓度-时间曲线；深蓝色方块点表示实测的血浆万古霉素平均浓度-时间数据点；A图为每12小时给药1000 mg的给药方案、B图为每6小时给药500 mg的给药方案)。见图3a，3b 表2 美国人单剂量及多剂量静脉滴注给药后，PBPK模型预测与临床观测的PK参数对比 注：AUC-PK曲线下的面积；P/O-预测与观测PK参数的比值 表3 中国人单剂量静脉给药后，PBPK模型预测与临床观测的PK参数对比 3.3 万古霉素在病人的PBPK模型 下图为心外科手术后肾功能改变的临床病人静脉给药万古霉素的预测结果与观测值，结果显示两者较为吻合。和正常人体相比，肾功能损伤患者的万古霉素 PK特征为：(a) 肾脏Tmax没有很明显的延长；(b)肾小管及肾脏中的万古霉素浓度都有上升；(c) 万古霉素在靶部位的浓度范围愈加变窄(肾小管：380.92-1446.21 μg/mL vs. 199.04-3932.52 μg/mL)；(d)当患者的肾功能损伤从中度变成重度时，万古霉素在肾小管及肾脏中的量及浓度都进一步降低。 多剂量静脉滴注给药后，心外科手术后肾功能改变的患者实测及PBPK模型预测的血浆、肾脏、肾小管浓度-时间曲线图(深蓝色、浅蓝色及绿色连续曲线分别表示预测的人体血浆、肾脏和肾小管平均浓度-时间曲线；深蓝色方块点表示实测的血浆万古霉素谷浓度-时间数据点)。见图4 3.4 细胞活性 该工作特别研究了在相对临床浓度下，万古霉素对肾脏近端小官上皮细胞株HKCs的活性影响。基于PBPK模型预测多剂量给药后，万古霉素在组织(特别是肾小管)的分布特性，设计了一系列浓度(0.125, 0.25, 0.5, 1, 2和4 mg/mL)的万古霉素，并考察对HKCs的影响。发现孵育24小时后，万古霉素浓度小于2 mg/mL时，其对HKCs的细胞毒性不明显；但是当浓度达到4 mg/mL时，万古霉素对细胞生长的抑制率达到16.5%，具有明显的细胞毒性。 3.5 鉴定可预测万古霉素引发肾毒性的生物标记物 通过研究，总共发现了12种可明显指示万古霉素引发肾小管功能改变的代谢产物，包括11种溶血磷脂酰胆碱和1种溶血磷脂酰乙醇胺，且溶血磷脂的释放量与万古霉素24小时的治疗浓度(0.125-4 mg/mL)具有明显的浓度依赖性。这些剂量依赖性的潜在生物标记物可用作反映万古霉素引发肾毒性的程度。 4. 模型讨论 对于毒理学的研究，发现药物暴露与毒副作用之间的关系非常重要，其中靶组织中的暴露水平是一个重要因素；但是获取临床患者靶组织的真实浓度几乎不可能的。因此本研究期望通过建立PBPK模型，以预测万古霉素在健康成人及ICU患者肾脏、肾小管中的分布。 基于推测的万古霉素肾脏毒性的机制主要是其导致肾脏近端小管功能紊乱，确定药物在肾小管中的暴露至关重要。借助建立的PBPK模型，可以发现万古霉素在肾小管和肾脏中的浓度要远高于血浆中的浓度。肾小管中的万古霉素浓度变化与血浆较为相似，但是暴露量约为血浆的40倍。但是万古霉素在肾脏中的分布与血浆有较大的差异，表现峰浓度的达峰时间滞后，药物的消除速率要远慢于血浆和肾小管；总的暴露量约是血浆的20倍。对比美国人的两种给药方案，可以很容易发现每6小时给药500 mg后血浆、肾脏及肾小管的万古霉素浓度范围(肾小管：316.11-2136.61 μg/mL)较每12小时给药1000 mg (肾小管：199.04-3932.52 μg/mL)要窄，但是血浆的谷浓度并没有明显的差异(监测血浆谷浓度可能并不能规避万古霉素的肾毒性)。对于临床患者的PBPK模型来说，发现万古霉素在靶部位的浓度范围愈加变窄(肾小管：380.92-1446.21 μg/mL vs. 199.04-3932.52 μg/mL)；当患者的肾功能损伤从中度变成重度时，万古霉素在肾小管及肾脏中的量及浓度都进一步降低。 建立在PBPK模型预测肾小管中万古霉素暴露水平的基础上，进一步研究了万古霉素对肾脏近端小官上皮细胞株HKCs细胞活性的影响(该工作采用模型预测的肾小管中万古霉素浓度：0.125-4 mg/mL )。研究结果提示较高浓度(4 mg/mL)的万古霉素对HKCs有明显的细胞毒性，这透露临床中万古霉素按照每6小时给药500 mg的安全性要好于每12小时给药1000 mg。 为了深入探寻万古霉素引发肾毒性的潜在生物标记物，该工作还进一步对万古霉素处理的肾脏近端小官上皮细胞株HKCs培养液进行了代谢组学的分析。本研究首次发现了一些溶血磷脂(大部分是溶血磷脂酰胆碱lysoPCs)的相对丰度与肾小管中的万古霉素具有明显的剂量依赖性。 5. 总结 该工作通过GastroPlus软件的PBPK建模，表明万古霉素引发的肾毒性主要由于其在肾脏及肾小管(最为主要)中的大量分布，从而导致了肾脏近端小管功能紊乱。该结果也进一步通过体外肾脏近端小官上皮细胞株HKCs毒性实验得以证实，并鉴定出可反映万古霉素临床给药后肾毒性的潜在生物标记物，以便更准确地提示临床给药后是否会引起患者的肾脏毒性。通过此细致的研究，表明PBPK模型对于处理靶部位暴露与响应之间的联系是一个非常有用的工具，它可以用于推测组织中药物浓度-时间曲线，以及深入研究靶器官的机理过程。 6. 应用软件与模块 该案例应用的软件是GastroPlus (version 9.6)，涉及模块有Base, PBPK, PKPlus, ADMET Predictor。 延伸阅读 杜海燕, 陈涛, 张文鹏, 等. 万古霉素健康人体生理药动学模型建立及其组织分布特征预测. 中国药理学与毒理学杂志. 2018 (3), 32 (3): 201-207.  表1.png  表2.png  表3.png  图1.png  图2.png  图3a.png  图3b.png  图4.png |
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