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victor_u

新虫 (小有名气)

[交流] 利用亲和层析纯化蛋白已有3人参与

利用蛋白纯化仪UEV 25D对样品进行亲和层析

纯化步骤
1.  将亲和介质在缓冲液中进行平衡。
2.  选择有利于将目标分子专一性结合到其互补的结合物质(配基)的条件,对样品进行纯化。目标物质具有专一性,可逆的结合到配基上,并且未被结合的
     物质可以被冲洗流出柱子。
3.  回收目标分子,改变缓冲液的条件,将结合的目标分子洗脱下来。
     洗脱这一步可以是选择利用竞争性配基进行特异性洗脱或者改变缓冲液的pH值、离子强度和极性进行非特异性洗脱。
     目标蛋白是以纯化的浓缩的形式被收集起来的。
4.  用结合缓冲液对亲和介质进行再平衡。

介质和缓冲液的准备
    在使用亲和介质进行纯化时,必须先彻底清洗掉亲和介质的储存液和防腐剂。
    使用0.45微米或者0.22微米的滤膜对缓冲液进行过滤,并在进行纯化之前去除缓冲液中的气体。

样品的制备
     应确保去除掉样品中已知的对结合有干扰作用的组分。
     在上样过程中,需要对样品的流速进行测试,特定的流速可以增加样品的结合效果。当样品与亲和介质的相互作用较弱时,需要较长的时间才能达到平衡,这时可在上样完毕后停止流速,这样在洗脱前就可以有更多的时间使目标蛋白与配基相互作用,然后再继续洗脱。或者可以将样品分批上样,都有利于目标蛋白与配基的结合。

洗脱
     在所有未被结合的物质都被缓冲液洗出柱子后(在280 nm紫外吸光度下不再出峰),再开始对目标物质进行洗脱,可以提高被洗脱的目标物的纯度。
     当样品与亲和介质的相互作用较强时,在开始洗脱后(一般为10 min – 2 h),可以停止流动一段时间,然后再继续洗脱。这样将会有更多时间使目标蛋白与配基之间解吸附,可以提高目标蛋白的回收率。

pH洗脱
     pH值的变化可以改变带电荷的配基基团和/或结合蛋白的离子化程度,这一改变或许通过影响它们的结合位点,降低它们之间的亲和性,或者是通过改变构象导致间接的改变它们之间的亲和性。

离子强度洗脱
     通过改变离子强度进行洗脱取决于配基和目标蛋白之间特殊的相互作用。这个洗脱方法较为温和,通过逐渐增加离子强度缓冲液(一般为NaCl)达到洗脱的目的,一般在洗脱中用线性梯度洗脱或者阶梯式洗脱。

竞争性洗脱
     选择性的洗脱经常用于分离一组特殊的培养基物质或者应用在当配基/目标蛋白的亲和力相对较高时。此种方法是基于洗脱剂与目标蛋白竞争结合配基的位点或者与配基竞争结合目标蛋白的结合位点。
     当用竞争的方式进行洗脱时,竞争化合物的浓度应该与配基的浓度相似。但如果竞争的化合物与配基的结合力比目标分子与配基的结合力更弱时,应使用高于配基浓度十倍的竞争化合物的浓度进行洗脱。

     在较低的洗脱液极性的条件下有助于目标洗脱物不失活,典型类型有二氧杂环己烷(10%)或者乙二醇(50%)。
     在其他洗脱方法都失败的情况下,可以尝试改变缓冲液形式使蛋白结构发生改变,例如促溶剂,如盐酸胍、尿。但可能使洗脱的蛋白发生变性,最好能够避免使用。
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一毛钱买断

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甘氨酸洗脱的蛋白冷冻保存再化开用的时候有不可复性的沉淀怎么回事

发自小木虫Android客户端
2楼2020-03-18 11:22:58
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victor_u

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 一毛钱买断 at 2020-03-18 11:22:58
甘氨酸洗脱的蛋白冷冻保存再化开用的时候有不可复性的沉淀怎么回事

推测是不是IgG析出了,可以提高盐浓度试试
3楼2020-03-18 15:00:21
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一毛钱买断

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3楼: Originally posted by victor_u at 2020-03-18 15:00:21
推测是不是IgG析出了,可以提高盐浓度试试...

和低ph洗脱关系大吗,保存体系也是甘氨酸tris,出了提高盐浓度还有别的办法吗后续实验原料离子强度不能太高

发自小木虫Android客户端
4楼2020-03-19 16:22:15
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pj261

新虫 (初入文坛)


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引用回帖:
4楼: Originally posted by 一毛钱买断 at 2020-03-19 16:22:15
和低ph洗脱关系大吗,保存体系也是甘氨酸tris,出了提高盐浓度还有别的办法吗后续实验原料离子强度不能太高
...

沉淀有几种可能,一种你最终收集的抗体样品中缓冲液pH与它的等电点比较接近析出了,另一种就是储存液的盐浓度低了,你的中和缓冲液tris里面NaCl浓度有多少,一般0.9%的浓度是要的。
5楼2020-03-20 08:57:04
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6楼2020-03-20 09:28:02
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