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【调剂】北京石油化工学院2024年16个专业接受调剂
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落日余晖34

木虫 (正式写手)

[求助] 毕赤酵母GS115电转pPICZαA-目的基因已有1人参与

楼主最近在做毕赤酵母GS115电转pPICZαA-目的基因，但是并未得到整合子。以下是我的步骤
1.毕赤酵母感受态的制备
（1）从YPD 平板上挑取毕赤酵母GS115单菌落至10 mL YPD培养基中，30 °C、200 r•min-1培养24 h；
（2）按1%  的接种量转接至装有50 mL YPD培养基中，30 °C、200 r•min-1培养约8 h（OD600=1.3-1.5）左右（测定有1.8），置于冰上冷却30min左右；
（3）将全部菌液转移至预冷的10 mL EP管中（分4管收集菌体）， 4 °C、4,000 r•min-1 离心5 min；
（4）弃上清，加入8 mL预冷的无菌水，将菌体沉淀轻轻吹吸均匀，冰上静置5min，4 °C、4,000 r•min-1离心3 min，弃上清，重复1次上述操作。
（5）参照（4）中的方法用8mL预冷的1 mol•L-1的山梨醇洗涤菌体3次。
（6）向EP管中加入500μL 1 mol•L-1的山梨醇重新悬浮菌体（每管加500μL），按每管100 μL的量分装于预冷的无菌的1.5 mL 离心管中，即获得毕赤酵母GS115感受态细胞。由于时间原因，做好的感受态在电转前暂存于-80度，大概放置了有1天的样子。
2.重组质粒的转化
（1）将经过SacI线性化的pPICZαA-EKL质粒DNA进行纯化回收（我切了有10μg质粒，线性化之后，，采用30μL无菌水，进行洗涤柱回收，最后烘干浓缩到10μL左右）；
（2）向毕赤酵母GS115感受态细胞中加入10 μL（5-10µg）线性化的质粒，轻轻吹吸混匀，冰浴静置5 min，
（3）将上述全部菌液转移至预冷的0.2 cm的电转杯中，1500 V，5 ms电击1次；
（4）电击完毕后立刻向电转杯中加入1 mL 1 mol•L-1的山梨醇，将菌液吹吸混匀，转移至已灭菌的1.5 mL EP管中，于30 °C恒温培养箱中培养1 h；
（5）3,000 r•min-1离心2 min，收集菌体取涂于含有Zeocin 100µg/ml的YPDS平板培养基上（大概重悬后有200μL，全部涂于一个平板上），30 °C恒温培养2~3天，直到有单菌落长出。
问题：1.没有得到重组整合子的原因，是不是分四管收集菌体，最后洗涤完之后每管加500μL，导致最后的菌浓稀释了？
          2.询问师姐得知线性化的质粒还是少了？10μg是否足够呢？
          3.由于是当天新倒的平板，涂板的有些湿，先正放等表面水干了，第二天再倒置培养，平板的湿度是否有影响呢？
求做过这方面的虫友看看哪里有问题呢？
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有时候总要努力下
1楼2020-03-15 10:20:59
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

zouyoutu

木虫 (正式写手)

可可
1：GS115电转的感受态必须很浓稠，200uL移液枪不太好吸得那种感觉最好。
2: 10ug重组质粒线性化后，用洗涤柱回收，有再测浓度吗？手册上写电转时要有10ug的线性化的重组质粒，实际操作至少也要有5ug以上。（我的经验是10ug转，感受态可以稀一点，5ug转的话，感受态就要很浓稠，参考第1点）。
3：电转后，孵育的时间不够，我记得手册上写在电转后，先冰育，然后再加入几ml山梨醇在30度孵育2小时，然后再加入培养基30度继续孵育1小时。因为你是用zeocin抗性，电转后要是没有孵育好，感受态没有回复正常，就算转进去了，也不容易在有抗性的的平皿上生长。如果你用组氨酸缺陷筛选，就不需要孵育这么久，甚至不需要孵育。
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14楼2021-04-08 16:58:16
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雪色残洋

铜虫 (小有名气)
我也做了pPICZαA-目的基因，表达载体和目的基因做了两次酶连以制备单克隆了，目前不知道啥原因就是不长菌。
不知道是感受态不行还是没转化进感受态，亦或是连接不成功？
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5楼2020-03-19 08:24:20
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zouyoutu

木虫 (正式写手)

可可
4：还有就是Zeocin浓度 50μg/ml时，转化子会多一些。 100μg/ml也行，但转化子会少。现在你没有转化子出现，建议 50μg/ml和100μg/ml各做一板。
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15楼2021-04-08 17:02:47
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普通回帖

落日余晖34

木虫 (正式写手)
毕赤酵母GS115电转pPICZαA-目的基因

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有时候总要努力下
2楼2020-03-15 10:21:52
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落日余晖34

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 落日余晖34 at 2020-03-15 10:21:52

电转完以后如上图所示，有白色的斑点，有两个我疑似的，但是跟正常的115长的不一样……

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有时候总要努力下
3楼2020-03-15 10:24:16
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biosci

捐助贵宾 (职业作家)
这些都不是，正常毕赤酵母菌落不是这样的

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4楼2020-03-18 10:34:08
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落日余晖34

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 雪色残洋 at 2020-03-19 08:24:20
我也做了pPICZαA-目的基因，表达载体和目的基因做了两次酶连以制备单克隆了，目前不知道啥原因就是不长菌。
不知道是感受态不行还是没转化进感受态，亦或是连接不成功？

连接不成功的话可以考虑无缝克隆连接

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有时候总要努力下
6楼2020-03-22 08:15:27
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ggdy3478

银虫 (小有名气)
估计感受态要新做的马上转，你现在看到的都是阴性菌

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青椒一个
7楼2020-03-24 21:40:35
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落日余晖34

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by ggdy3478 at 2020-03-24 21:40:35
估计感受态要新做的马上转，你现在看到的都是阴性菌

培养了大概3天多长出来的，但是后面接摇瓶，添加抗性，也能生长这就很奇怪了。

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有时候总要努力下
8楼2020-03-24 23:03:22
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ggdy3478

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 落日余晖34 at 2020-03-24 23:03:22
培养了大概3天多长出来的，但是后面接摇瓶，添加抗性，也能生长这就很奇怪了。
...

那就提取菌体DNA PCR验证一下
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青椒一个
9楼2020-03-25 10:12:36
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落日余晖34

木虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by ggdy3478 at 2020-03-25 10:12:36
那就提取菌体DNA PCR验证一下...

昨天跑了蛋白胶，今天看了下图，虽然在理论大小附近有条带，但是上清蛋白太低了……浓缩10倍左右才能看到，而且拖尾现象明显，哎

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10楼2020-03-25 23:27:10
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