| 查看: 3602 | 回复: 21 | ||||
| 【悬赏金币】回答本帖问题，作者众里124将赠送您 20 个金币 | ||||
[求助]
原核表达重组蛋白，带有HIS标签，用镍柱纯化后，有很多杂蛋白，如何能除去？已有2人参与
|
||||
|
我尝试了透析，用超滤管进行超滤的方法，一定程度上好像减少了杂蛋白。 但是我要用纯化的蛋白刺激细胞，进行后续实验，对纯度要求较高。 求问还有什么方法？太贵的我用不了，实验室太穷了  @hc-material @gyesang 发自小木虫Android客户端 |
回复此楼» 猜你喜欢
25年博士申请
已经有4人回复
-
Nature一直在编辑手里，考虑好几天了，是悬了吗
已经有11人回复
-
基金开始函评了吗？
已经有11人回复
-
召集青年编委
已经有9人回复
-
博士论文被抄袭
已经有39人回复
-
期末给学生划重点都是什么话术啊
已经有18人回复
-
with editor 两个月了，什么原因？
已经有8人回复
-
普通院校药学硕士，做合成的，感觉找不到工作
已经有11人回复
-
求博导
已经有10人回复
-
博士白读了
已经有41人回复
hc-material
专家顾问 (职业作家)
-
专家经验: +702 - BioEPI: 1
- 应助: 517 (博士)
- 金币: 520.3
- 散金: 17728
- 红花: 312
- 帖子: 3550
- 在线: 516.4小时
- 虫号: 4027804
- 注册: 2015-08-18
- 性别: GG
- 专业: 核技术及其应用
- 管辖: 生物科学
|
镍柱纯化蛋白通常纯度85%左右，纯化的洗脱的洗脱峰可以直接过复合型离子交换柱，，进行继续纯化，过复合型离子交换柱，看纯度，若还不够，继续下下步离子交换，或者凝胶过滤层析，在这些之前先优化下镍柱纯化的洗脱模式，比如拉咪唑梯度，缓冲液盐浓度优化等，详细可以加微信咨514099167交流 发自小木虫IOS客户端 |
2楼2020-03-12 23:55:19
ECUST_CAPF
铜虫 (小有名气)
- 应助: 7 (幼儿园)
- 金币: 587.8
- 帖子: 241
- 在线: 27.4小时
- 虫号: 21351119
- 注册: 2020-03-04
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
|
这个具体你是如何操作的？ binding之后直接洗脱？使用重力柱还是预装柱？手动还是仪器自动？洗脱方式等度？梯度？ 照目前你提供的信息仅仅只能判定洗脱时有大量的杂蛋白非特异性结合在了Ni beads上，造成目前结果，后期处理是很困难的，即使有效你也会损失样品 所以，有如下建议： 1. binding之后你要用buffer wash一下beads，具体wash体积要根据不同试验和beads使用状态，一般wash两三个柱体积差不多 2. 洗脱时建议梯度进行，100-250mM 咪唑，可以100-150-200，梯度洗脱，取样跑胶，如若接在AKTA上，那就线性洗脱 3. 如果以上两步作用微小，说明非特异性结合很强，你可以在wash buffer中加入少量咪唑wash ，20-50mM 其他的需要你提供详细的操作步骤来分析原因 希望可以帮到你 |
3楼2020-03-13 13:50:52
ECUST_CAPF
铜虫 (小有名气)
- 应助: 7 (幼儿园)
- 金币: 587.8
- 帖子: 241
- 在线: 27.4小时
- 虫号: 21351119
- 注册: 2020-03-04
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
4楼2020-03-13 13:55:32
ECUST_CAPF
铜虫 (小有名气)
- 应助: 7 (幼儿园)
- 金币: 587.8
- 帖子: 241
- 在线: 27.4小时
- 虫号: 21351119
- 注册: 2020-03-04
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
5楼2020-03-13 13:59:43
lenaimiao
金虫 (正式写手)
- 应助: 2 (幼儿园)
- 金币: 1118.9
- 散金: 1197
- 红花: 19
- 沙发: 1
- 帖子: 856
- 在线: 37.9小时
- 虫号: 5352669
- 注册: 2016-12-14
- 性别: GG
- 专业: 生物物理、生物化学与分子
|
蛋白上样后用20-50mM的咪唑洗下杂，最后用500mM咪唑洗脱，一般固定套路就这样。有条件的话像前面说的线性洗脱会更方便点。之前见过手动柱子，上样混匀摇1h，20mM咪唑摇0.5，50mM 0.5，最后500摇1h收样 发自小木虫Android客户端 |
6楼2020-03-13 14:37:55
 我用的是碧云天的手工纯化试剂盒，将细菌裂解上清与液体状态的镍柱混合之后装的重力柱，binging之后用2mM 咪唑wash五个柱体积，再用50 mM 咪唑洗脱1.我曾经增加过洗涤液的咪唑浓度，分别增加了5mM、10mM、20mM，但是增加之后目的蛋白被大量洗脱，最终得到的蛋白里还是有杂蛋白 2.我尝试过梯度洗脱，但目的蛋白在低浓度咪唑里已经可以被大量洗脱，所以意义不大 3.我看其他人文章里纯化蛋白用的咪唑浓度都不止这么点，但这个试剂盒就是这样.....我也不太懂 4.离子交换柱价格在1万以上了吧，导师不允许花这么多，很穷 5.我的用途就是用来作为一个刺激因子，测细胞对它的反应 6.我查到一种试剂盒是用磁珠来进行磁性分离纯化，不知道这种能不能增加纯度 实验师没条件真的觉得进行不下去了，还不如一开始就让公司做出蛋白给我，因为我的实验主题是细胞对这种蛋白的反应，不是如何制作这个蛋白啊 |
7楼2020-03-14 13:03:59
8楼2020-03-14 13:10:26
9楼2020-03-14 13:11:55
lenaimiao
金虫 (正式写手)
- 应助: 2 (幼儿园)
- 金币: 1118.9
- 散金: 1197
- 红花: 19
- 沙发: 1
- 帖子: 856
- 在线: 37.9小时
- 虫号: 5352669
- 注册: 2016-12-14
- 性别: GG
- 专业: 生物物理、生物化学与分子
10楼2020-03-14 17:26:29
66