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【调剂】北京石油化工学院2024年16个专业接受调剂
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lzk234

铜虫 (小有名气)

[求助] CRISPR/Cas9的问题已有2人参与

请求各位大佬给小弟解答，最近在大肠杆菌(BL21（DE3）)中做Cas9，每次电转第一个Cas9质粒很正常，但是电转第二个含有sgRNA的Target质粒后涂板总是不长，请问各位大佬这是什么原因。

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1楼2020-01-16 10:52:23
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hya1968


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2楼2020-01-17 09:59:29
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匿名

用户注销 (正式写手)
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3楼2020-01-17 10:56:58
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lzk234

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 小木无虫 at 2020-01-17 10:56:58
你能在bl21中转进去？

第一个含有Cas9的质粒完全可以转进去，就是第二个质粒转的时候老是出问题

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4楼2020-01-17 14:44:06
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lzk234

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 小木无虫 at 2020-01-17 10:56:58
你能在bl21中转进去？

我的是转完第二个质粒以后总是不长，一个也不长。

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5楼2020-01-17 14:52:57
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源井生物

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

菌的基因编辑，一般转染crispr/Cas9系统的同时，还需要加入修复模版的，有没有先将修复模版转入菌里面呢？或者可以考虑共转化；大肠杆菌的基因编辑的话，这块比较简单，如果不是非常必要的话，一般送出去公司构建就可以了
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6楼2020-05-09 13:26:44
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FYH2015

捐助贵宾 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 源井生物 at 2020-05-09 13:26:44
菌的基因编辑，一般转染crispr/Cas9系统的同时，还需要加入修复模版的，有没有先将修复模版转入菌里面呢？或者可以考虑共转化；大肠杆菌的基因编辑的话，这块比较简单，如果不是非常必要的话，一般送出去公司构建就 ...

貌似BL21比K12什么的要难。。。看了些文献 说BL21修饰的比较多 也不知道是真是假
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7楼2020-05-18 19:20:09
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HK驱魔者

铁虫 (正式写手)
你的Bl21基因敲除做出来了没，可以给点经验吗
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8楼2020-07-29 14:29:41
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源井生物b

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

多次电转可能对菌株造成影响，后面的电转效率会非常的低，可以把cas9和gRNA构建到一个载体上
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https://www.ubigene.com/
9楼2021-02-10 11:31:13
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hnnydx

木虫 (著名写手)
制备高效电转细胞

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10楼2021-04-17 11:26:48
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