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littletracy金虫 (小有名气)
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使用潮霉素，壮观霉素抗性的质粒构建载体，空白DH5a平板上成片菌膜生长已有2人参与
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大家好，请教一下，我使用整合型质粒，pMS82（潮霉素抗性）和pPM927（壮观霉素抗性）连接基因片段构建重组载体，使用吉布森组装法构建载体。 在实验过程中发现，转化DH5a感受态细胞后，37度培养过夜，平板总是成片生长，而没有单个菌落。 为了验证是否是抗性的问题，重新买了潮霉素（易见光分解），配置好母液（浓度是50 mg/ml），使用浓度是 50 ug/ml（参考链霉素资料）。在分别含有潮霉素和壮观霉素的LB液体培养基中，分别培养pMS82和pPM927菌，空白的DH5a作为对照。在12小时内，pMS82和pPM927菌正常生长，DH5a基本上没有生长，培养液基本澄清，但是在16-20小时后，DH5a在潮霉素培养基中也能够开始明显生长，菌液浑浊。我当时认为可能是潮霉素不稳定的原因，把平板生长的时间控制在12小时以内即可。 然后用双酶切线性化好的载体pMS82，pPM927分别连接基因片段，吉布森组装后转化DH5a感受态细胞，同时将空白的DH5a感受态细胞作为对照，分别涂布潮霉素和壮观霉素平板。平板是现用现配的，浓度是50 ug/ml。37度培养过夜后，仍然看到实验组和对照组都是长成一片菌膜，而没有单个菌落生长。尤其是潮霉素的平板。 想请教各位高手，有没有这种经验，到底是什么原因导致现在的结果呢？ 请大家多多指教，感激不尽！ P.S. 实验室常用的载体是氨苄青霉素和安普霉素抗性，这两个抗性的载体连接组装没有出现过一片菌膜的现象，并且最近使用安普霉素抗性的质粒成功构建过载体。DH5a对其它载体，其它抗性也是能够正常使用的。我是最近刚开始用这两个载体，pMS82和pPM927，对这两个载体不熟悉，潮霉素和壮观霉素抗性也是第一次用，不知道是这两个抗生素到底是什么地方我做的不对，导致了现在的问题。 附上37度培养12小时的平板图片，请大家多指教，再次感谢！  20191218 潮霉素DH5a空白平板.jpg  20191218 潮霉素组装平板.jpg  20191218 壮观霉素DH5a空白平板.jpg  20191218 壮观霉素组装平板.jpg |
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2楼2019-12-19 21:49:01
littletracy
金虫 (小有名气)
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帕戴维
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楼主好，我最近用潮霉素，发现几次重复筛选抗性不稳定。有时候80ug/ml，甚至后面100，200都长了。是不是因为平板经常拿出观察，导致潮霉素见光分解极不稳定？ 发自小木虫Android客户端 |
5楼2020-10-30 23:58:46
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