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【调剂】北京石油化工学院2024年16个专业接受调剂
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天才小能猫?

金虫 (正式写手)

[求助] 真诚求助求助各位大神硝基还原酶的使用条件 可以解决问题的同学我会给发100rmb的红包已有1人参与

我这边最近在做硝基还原酶还原4-硝基苯酚的实验 可是总是没办法还原
文献中的方法：NADH 硝基还原酶 4-硝基苯酚 37°C ph.7.4 一小时内就会还原
我这边用的是500μmol NADH；20μg/ml 硝基还原酶；50μmol 4-硝基苯酚；1X的ph=7.4的PBS 在37°C 反应了一天 HPLC检测 我手里有4-氨基苯酚的标样
可是跑HPLC的时候发现原料峰没有明显降低 标样前后保留时间有两个小峰即使会是产物 产率也不超过10%
请问问题会出在什么地方？
NADH是现用现配的 不过就是国产源叶生物的 酶是S-A的用PBS分装 -20冻存 硝基苯酚是安耐吉买的
我的qq是915937220 欢迎指点 感激不尽！
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1楼2019-11-23 09:45:15
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xl0071334

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2019-11-23 21:39:30
可能你的NADH浓度太低，可以用辅酶循环再投一下反应。要么用现有的NADH测一下酶活，！

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2楼2019-11-23 20:20:53
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天才小能猫?

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xl0071334 at 2019-11-23 20:20:53
可能你的NADH浓度太低，可以用辅酶循环再投一下反应。要么用现有的NADH测一下酶活，！

谢谢大神解答 不过我看类似的文献中NADH的浓度都是500微摩尔 就算是浓度低也不应该一点也不反应诶 请问您这边有试过类似的反应吗 有没有一些细节的问题？恳请大神不吝指教，万分感谢！
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3楼2019-11-23 21:49:56
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xl0071334

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ...
天才小能猫?: 金币+100, ★★★很有帮助 2019-11-25 11:50:31
引用回帖:
3楼: Originally posted by 天才小能猫? at 2019-11-23 21:49:56
谢谢大神解答 不过我看类似的文献中NADH的浓度都是500微摩尔 就算是浓度低也不应该一点也不反应诶 请问您这边有试过类似的反应吗 有没有一些细节的问题？恳请大神不吝指教，万分感谢！...

在340nm下用吸光度法先测定一下酶活，我投反应时加辅酶循环的。另外HPLC时最好加上底物和产物定位。

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4楼2019-11-24 05:48:17
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天才小能猫?

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by xl0071334 at 2019-11-24 05:48:17
在340nm下用吸光度法先测定一下酶活，我投反应时加辅酶循环的。另外HPLC时最好加上底物和产物定位。
...

很不好意思，我是有机化学出身的，做酶也是刚开始搞一知半解，请问辅酶循环是怎么做的？还有测酶活 就是把底物辅酶和酶都加进去  37度反应然后检测340的吸光度的降低情况对吗？ 我查了查资料 也还是不太懂 请您多多指点
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5楼2019-11-24 17:02:22
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天才小能猫?

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by xl0071334 at 2019-11-24 05:48:17
在340nm下用吸光度法先测定一下酶活，我投反应时加辅酶循环的。另外HPLC时最好加上底物和产物定位。
...

还有一个细节 我这边买酶的时候一个小瓶子里是一毫克的酶 加上冻干粉和糖一共是 30毫克 我这边是取出几个毫克的 固体来溶解分装的 会不会是 酶和冻干粉没有混合均匀 取出来的时候没有带上酶
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6楼2019-11-24 17:09:34
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xl0071334

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 天才小能猫? at 2019-11-24 17:09:34
还有一个细节 我这边买酶的时候一个小瓶子里是一毫克的酶 加上冻干粉和糖一共是 30毫克 我这边是取出几个毫克的 固体来溶解分装的 会不会是 酶和冻干粉没有混合均匀 取出来的时候没有带上酶...

你加我的微信吧，疯子磊，xielei01

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7楼2019-11-24 23:16:45
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xhy0821

新虫 (初入文坛)
请问您在用硝基还原酶的时候，把酶溶解在那种pbs里呢，是用的那种pbs呢，

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8楼2022-07-11 10:19:56
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