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重叠PCR，屡次失败，求助大神们
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| 最近在做重叠pcr，片段A（409bp）、B（1777bp），目的片段为2100多bp。我的做法是，第一轮用引物对E\F扩增出A、R\T扩增出B、胶回收，引物F和R有26bp重叠，重叠部分Tm59℃。第二轮用片段A和B为模版，不加引物扩增5循环，然后用加引物E和T扩增25循环。（10ul体系：酶5ul；片段A 15ng；片段B 45ng；引物E\T 各0.5ul；水补到10ul）（反应条件：94℃ 2min；98℃ 10s，58℃ 5s，72℃ 40s；72℃ 2min）5和25循环条件都是如此，用的是塔克拉的快速高保真酶。但是总是没有目标条带，而在600bp位置出现非特异条带，而且条带非常的亮。退火温度也换过53℃，55℃，60℃，结果都是一样。大伙觉得我这是哪里出了问题，有没有好的解决办法呢？ |
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6楼2019-11-13 17:25:00
10楼2020-03-11 15:16:36
2楼2019-11-11 18:26:43
3楼2019-11-12 18:10:04
★
whichme(金币+1): 谢谢参与
whichme(金币+1): 谢谢参与
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一是可以重新设计引物，增加A、B片段的重叠部分长度；二是可以用SLIC直接将AB整合到某个质粒上，以后直接用该质粒做模板，不必重复做overlap PCR 发自小木虫Android客户端 |
8楼2019-11-15 15:33:37
9楼2019-11-18 09:09:18
13楼2022-07-10 17:45:48
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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|
本帖内容被屏蔽 |
15楼2022-08-22 16:32:42
16楼2022-08-27 21:27:56
简单回复
psylhh4楼
2019-11-12 22:42
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whichme(金币+1): 谢谢参与
2019-11-13 15:31
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whichme(金币+1): 谢谢参与
tzynew7楼
2019-11-14 07:00
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whichme(金币+1): 谢谢参与
nono200911楼
2021-10-03 14:43
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whichme(金币+1): 谢谢参与
·
刀劈三关12楼
2021-10-04 21:52
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。
bjdxyxy14楼
2022-07-10 18:31
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whichme(金币+1): 谢谢参与
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