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冬日暖阳新虫 (正式写手)
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蛋白纯化一直有杂蛋白，去不掉怎么办呀
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最上面的是我的蛋白，从左到右，咪唑依次为200mM,100.80.70.60.50,40 缓冲液是PBS，求指导  @hc-material @gyesang 发自小木虫Android客户端 |
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看咪唑洗脱的胶孔处有大聚集体未进入PAGE。如果是菌体或者破菌沉淀样品进行电泳的话，胶孔有聚集体可以理解，但是洗脱样品电泳胶孔出现大聚集体就不正常了，因为理论上你的洗脱成分主要是蛋白质以及部分水溶性很好的非蛋白杂质，Loading中SDS和还原剂理论上是完全能够将疏水聚集体和二硫键错配的聚集体给打开的，所以胶孔不应该出现这么某明显的条带。 1. Loading Buffer终浓度太稀，或更可能是Loading Buffer所含还原剂浓度太低或样品电泳前加热时间长，二硫键氧化，导致部分样品二硫键错配。 建议：增加Loading的比例，加热后，待温度恢复至40℃左右，补加高浓度 β-ME，5-10min后上样电泳 2. 以上是电泳问题。由此推测你的蛋白含多个Cys，可能你纯化时还原剂的量不够，导致你的目的蛋白和带Cys的杂蛋白发生二硫键错配，所以目的蛋白和杂蛋白共价连接，一起结合在Ni柱上，无法分离。 建议：合理提高还原剂浓度。另外在胶孔较远的地方做一个洗脱样品的非还有电泳作为比较，确认你洗脱液中目的蛋白是否为单体（严重怀疑不是） 3. 6xHis结合Ni填料是通过咪唑基N原子与Ni形成配位键结合的，而除了咪唑基以外像Cys的巯基、Trp的吲哚基都能与Ni螯合，所以当杂蛋白有连续或间隔出现几个以上氨基酸时就会与填料有不同强度的结合；另外氨基酸侧链与填料之间还有较弱的静电作用力的影响。所以会存在杂蛋白不同程度的非特异性吸附。 建议：根据你的填料，在buffer中添加合适浓度的咪唑，Ni-NTA一般加20mM，Ni-IDA好像是50mM（好几年没用了，记不太清了），实际情况根据不同蛋白性质决定；另外Buffer中至少添加300mM NaCl 4. 你的蛋白即使没有形成包涵体，破菌上清也有可能是可溶性多聚体，即破菌上清中的目的蛋白结构混乱，与杂蛋白发生疏水聚集（也可能是二硫键错配），形成的聚集体粒径不足以形成胶体或沉淀，导致纯化过程中杂蛋白与目的蛋白一起挂柱，类似第2条。 建议：从疏水性和二硫键错配角度优化破菌Buffer，能解决得到单体最好（分子筛、还原非还原电泳或HPLC等方法检测），如果是聚集体尝试复性（持久战）或重新设计表达。 |
12楼2019-11-06 16:45:54
冬日暖阳
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2楼2019-11-04 19:24:52
yubeihong
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3楼2019-11-04 19:48:05
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4楼2019-11-05 09:28:59
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6楼2019-11-05 23:59:32
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7楼2019-11-05 23:59:52
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杂蛋白可能带了1个或2个his，结合在填料上，低ph可以让结合弱的蛋白给流穿，或者低咪唑洗脱下来。如果还不行，用akta拉梯度洗脱，找到准确的洗脱咪唑浓度 发自小木虫Android客户端 |
8楼2019-11-06 07:51:38
冬日暖阳9楼2019-11-06 07:52:23
冬日暖阳
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10楼2019-11-06 13:52:40
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