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toxicpeach木虫 (正式写手)
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多肽只有一个苯丙氨酸,没有酪氨酸和色氨酸怎么定量，定纯度已有1人参与
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请教各位大侠：我表达的多肽只有一个苯丙氨酸,没有酪氨酸和色氨酸，电泳看条带很亮，BCA定量变化范围大，送公司测序说HPLC未发现峰，想要测序怎么定量，定纯度？ @hc-material @gyesang 发自小木虫Android客户端 |
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易晓伟
铜虫 (正式写手)
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2楼2019-10-25 12:19:25
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3楼2019-10-25 12:51:43
zsygxh
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【答案】应助回帖
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toxicpeach: 金币+10, ★有帮助, 谢谢，你说的这个方法我还不是很懂，需要再学习一下哦 2019-11-01 23:29:04
toxicpeach: 金币+10, ★有帮助, 谢谢，你说的这个方法我还不是很懂，需要再学习一下哦 2019-11-01 23:29:04
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在280有光吸收的只有色氨酸、酪氨酸和半胱氨酸氧化形成的胱氨酸，苯丙氨酸在260附近有较高光吸收，但在280处几乎没有光吸收，所以280检测不出目的蛋白是正常的。 定纯度就用HPLC，用214鉴定，不要用280 对于不含这些氨基酸的蛋白或多肽可以尝试用Scopes法测定，但这种方法用的是经验公式，可能有误差，而且Buffer成分可能也会有影响，如果测定线性和重复性比较好的话可以使用。 如果Scopes法定量不合适，然后HPLC214检测纯度较高的话，根据你蛋白的氨基酸组成，选择一种比较合适的其它方法了，如Bradford、BCA等等，注意控制Buffer成分的影响，只要线性可以的话，那么也能较为准确地定量了。 如果HPLC检测纯度差，或目的蛋白有多种结构的峰，那么确认哪个峰是你要的峰。然后HPLC制备这个峰的蛋白，得到高纯度的目的蛋白，称量多个容器，然后按不同体积分装，冷冻干燥，分析天平称量，得到一个质量的线性图，再将冻干粉变性溶解（不加还原剂，避免破坏二硫键），HPLC定峰面积，这样就能得到一个214目的峰的峰面积与称量质量的关系式了，以后只要用HPLC214定峰面积就能折算浓度了。（方法对操作精确度要求高，但获得关系式后定量、定纯度都比较精准。注意冻干容器最好用较深一点的，避免样品外飘） |
4楼2019-10-28 13:26:15
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5楼2019-11-01 17:08:51
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