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做NF-KB通路，细胞核、细胞质中蛋白提取 不太懂啊，求助大神！！已有1人参与
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我想做动物组织的NF-kB通路，请问这个也可以既做细胞质又做细胞核中的蛋白WB吗？查文献发现大家细胞这样做的比较多一些，不知道动物组织是否也可以这么做？ NF-kB需要从胞浆中转到细胞核中，才能引发转录，生成某些因子 |
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2楼2019-08-25 08:51:57
wanghm200810
铁虫 (小有名气)
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【答案】应助回帖
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动物组织的也可以，算体内实验，细胞的算体外实验。上升一个层级。组织胞质胞核分离你可以看看这个 MinuteTM新鲜/冷冻组织胞质胞核分离试剂盒 目录号：NT-032 描述： 从细胞和组织中分离细胞质和细胞核组分是一种常见的实验。细胞样品的组分分离相对简单直接，然而，从组织样品中特别是冷冻组织中将胞质和胞核组分分离干净是很具挑战的。因为冷冻和反复冻融会引起组织细胞结构的改变，加之不适当的匀浆方式和效率低的提取缓冲液，使得交叉污染十分严重。目前大多数商业试剂盒设计可同时用于细胞和组织样品，但是忽略了两种类型样品之间的结构差异。因此，从新鲜/冷冻组织中分离胞质和胞核组分时，交叉污染问题无法避免(见下文参考文献1和2)。这款新型的胞质和胞核分离试剂盒专用于组织样品的胞质胞核分离，试剂盒特有的缓冲液体系和独特的操作方法可以将交叉污染降到最低。整个操作可以在30分钟内完成。 应用： 可应用于SDS-PAGE，immunoblottings，ELISA，IP，蛋白定位，凝胶迁移分析，2-D等其他应用。 试剂盒组分 1.缓冲液A 25ml 2.缓冲液B 10ml 3.缓冲液D 1.5ml 4.缓冲液N 1.5ml 5.1.5ml离心管 40个 6.1.5ml研磨杵 2个 7.蛋白质提取粉 2克 运输：常温运输 储存：常温保存 重要产品信息 1. 实验开始前将缓冲液A和缓冲液B冰上预冷。 2. 所有的离心步骤请使用4度或冷冻离心机。 3. 使用前推荐将蛋白酶抑制剂加入分装的缓冲液A中。 4. 研究蛋白磷酸化，磷酸酶抑制剂应在使用前加入分装的缓冲液A和缓冲液B中。 5. 推荐使用BCA试剂盒用于蛋白浓度测定。 6. 当室温低于20度时缓冲液D中可能出现白色沉淀，使用前可将缓冲液D在37度水浴锅加热溶解沉淀。 操作方法： 1、 取20-30mg新鲜或冷冻组织样品，放入试剂盒提供的1.5ml离心管中，加入250ul缓冲液A覆盖组织，冰上孵育5分钟。使用提供的研磨杵轻轻的扭转研磨样品1分钟（40-60次）。研磨杵可以重复使用，用清水清洁后，用纸巾擦干即可。 2、 14000 X g，离心5分钟。转移200μl上清液(胞质组分)到新的自备的离心管中保存。(如果上清液不够澄清, 14000 X g，再离5分钟进一步澄清)。如上所述用研磨杵再次把沉淀进一步研磨 (研磨60-100次)。研磨杵放置于管中，加入0.8 ml缓冲液A到管中。再研磨几次，拿出研磨杵。用1毫升吸头上下吹打15-20次混匀。在冰上孵育5-8分钟，让大的组织碎片通过重力作用沉到底部，将0.7 ml的上清液转移到一个新的试剂盒提供的1.5 ml管中(尽量避免管底大的组织碎片)。 3、 500xg，离心2 min，弃去上清液。加入0.5 ml的缓冲液B，涡旋振荡10-20秒重悬沉淀。冰上孵育5分钟，2000 X g离心2分钟，完全去除上清液。 4、 沉淀是分离的细胞核，根据不同的下游应用有两种核蛋白提取方式可选： A .变性核蛋白提取（提取出的核蛋白适用于SDS-PAGE、Western blotting等应用） 用50μl缓冲液D重悬沉淀(悬液可能粘稠，这是正常的)。称取50-60毫克的蛋白提取粉，加入沉淀(尽量避免接触管壁)。用研磨杵扭转研磨约60-100次。研磨杵仍置于离心管中，加入50 -150ul的缓冲液A到管中，再研磨几次(使用缓冲液A的多少取决于沉淀的大小。研磨杵可以重复使用，用清水清洁后，用纸巾擦干即可)。14000 X g，离心5分钟。将上清液转移到一个新的自备离心管中(即是细胞核蛋白)。可将蛋白酶抑制剂添加到核蛋白溶液中并储存于-20或-80度。蛋白质浓度一般为1-2mg/ml。 B .非变性核蛋白提取（提取出的核蛋白适用于ELISA、IP、酶活性测定、凝胶缓凝等应用） 用50μl缓冲液N重悬沉淀。室温孵育5分钟。称取50-60毫克蛋白提取粉加入沉淀(尽量避免接触管壁)。用研磨杵扭转研磨约60-100次。研磨杵仍置于离心管中，加入50 -150ul的缓冲液A到管中，再研磨几次(使用缓冲液A的多少取决于沉淀的大小)。10000 X g，离心5分钟，将上清液转移到一个新的自备离心管中(即是细胞核蛋白)。可将蛋白酶抑制剂添加到核蛋白溶液中并储存于-20或-80度。蛋白质浓度一般为0.5-1mg/ml。 关于胞质和胞核内参 许多抗体在WB中被用于检查组分分离的交叉污染。文献中常用的胞质内参包括但不限于GAPDH，HSP90，LC3 A/B，tublin，HIF1，ESR1，ACTB和Actin等。我们推荐使用GAPDH，HSP90或LC3 A/B,不推荐β-actin，因为Actin也存在于细胞核(见参考文献3和4)。核内参我们推荐LaminB1，LaminA/C，SC-35或histones。 参考文献 1. Kuster et al (2011) Nuclear protein extraction from frozen porcine myocardium. JPhysiol. Biochem. 67:165-173. 2. Murray et al (2009) Assessment of ProteoExtract subcellular fractionation kit reveals limited and incomplete enrichment of nuclear subproteome from frozen liver and heart tissue. Proteomics. 9(15):3934-3938. 3. Dopie et al (2012) Active maintenance of nuclear actin by importin 9 supportstranscription. PNAS E544-E552. 4. Falahzadeh et al (2015) The potential roles of actin in nucleus. Cell J. 17:7-14. |
3楼2019-09-11 14:50:27
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