| 查看: 1874 | 回复: 4 | ||
| 【悬赏金币】回答本帖问题，作者pengyuyt将赠送您 5 个金币 | ||
pengyuyt新虫 (初入文坛)
|
[求助]
稳转细胞系构建已有2人参与
|
|
|
各位大神，我目前在构建稳转过表达细胞系。目前遇到一些问题，请各位解答。 1.我的目的基因在cmv启动子后，ecor1和bamh1中间，gfp的表达是ef1α控制。目的基因大小是800bp。 2.病毒包装采用三质粒系统，感染hek293t，48h，72h收集病毒上清，没有浓缩，未检测滴度。此时gfp很明显。 3，用病毒感染目的细胞（panc-1和capan-2都试过）24h后，嘌呤霉素筛选，浓度5ug/ml，筛选了14天，gfp在空载的细胞中表达明显，但是在目的基因过表达的细胞gfp微弱，如图所示，上面的是空载，下面是过表达。wb检测约有3倍的增加。但表型上变化极其微弱。  qq截图20190714172402.jpg 我想问这是否可能是gfp的亮度过低导致的，是不是意味着只有很少一部分过表达，应该如何调整。 再次感谢各位！  pcdh-sequence.jpg |
回复此楼» 猜你喜欢
求博导
已经有9人回复
-
基金开始函评了吗？
已经有8人回复
-
国社科项目，你们学校都限额申报吗？
已经有10人回复
-
博士论文被抄袭
已经有38人回复
-
真的好想读博！
已经有17人回复
-
南京大学-广州大学联合招聘博士后 欢迎广大优秀人才！！！
已经有12人回复
-
with editor 两个月了，什么原因？
已经有6人回复
-
Nature一直在编辑手里，考虑好几天了，是悬了吗
已经有9人回复
-
耗材发问
已经有4人回复
-
"颜宁:基础研究应顶天立地"能做到基础研究同时顶天立地的才是牛人
已经有3人回复
2楼2019-07-15 10:42:53
3楼2019-07-15 10:46:19
prthefu
木虫 (著名写手)
- 应助: 20 (小学生)
- 金币: 2573.9
- 散金: 81
- 红花: 14
- 沙发: 1
- 帖子: 1551
- 在线: 187小时
- 虫号: 3083070
- 注册: 2014-03-24
- 性别: MM
- 专业: 生物海洋学与海洋生物资源
4楼2019-07-15 11:43:00
pengyuyt
新虫 (初入文坛)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 53.2
- 帖子: 17
- 在线: 6.5小时
- 虫号: 12865789
- 注册: 2018-11-16
- 性别: GG
- 专业: 抗肿瘤药物药理
|
谢谢您的答复。想和您交流一下。 1.之前我们实验室有师兄师姐尝试，但一直没有浓缩。之前用的通用方法是1ml的病毒液+0.5ml新鲜培养基，以及6ug/ml polybrene,最近我买了浓缩试剂盒打算试一下。病毒滴度是一直没有测过。 2.药物筛选浓度之前摸索过，用的0.5,1,3,5ug/ml,选的是72h完全杀死细胞的最小浓度，第一次用的3ug/ml，后来提高到5ug/ml ，之前还有一段时间用过8ug/ml，但细胞后面不会死亡，而且绿色依旧是这个状态。 3.个人觉得GFP在空载和过表达中也应该是一样的，但实际情况是过表达会弱一点，而空载会相对强一些。有可能是因为这两个基因表达是受不同启动子调控，整合存在竞争关系吗？WB看的是目的基因，我没有检测gfp 4.表型是过表达以后我的化合物敏感性提高，之前在瞬转中验证了这个结果，于是构建了稳转细胞系。而这次的差异非常小。 |
5楼2019-07-15 20:24:39
