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【调剂】北京石油化工学院2024年16个专业接受调剂
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五毛大肥猪

新虫 (初入文坛)

[求助] BL21验证已有3人参与

求助各位大神 我最近在转化BL21 菌落PCR验证有条带 但是条带很淡 用来表达蛋白却没有目的蛋白 请问这是没转化成功吗？

BL21验证


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1楼2019-07-09 21:04:32
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a112233a

新虫 (小有名气)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2019-08-18 22:00:57
亮度太小不可信 ，如果转化的好，应该非常亮

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3楼2019-07-10 08:04:40
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xinxiyuzhou

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2019-08-18 22:01:06
不正常，你的前期验证确定都是对的吗?导入DH5a后PCR结果呢？提的质粒验证了？然后如果前期验证都是对的，那你需要考虑你的BL21是否是BL21，找别人借一下或者自己再重新购买，表达菌株也不贵。还有，做PCR时做一个水的空白对照。
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7楼2019-07-11 08:56:32
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sannny

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
PCR无所谓条带亮度。亮度只能说明Pcr条件不是最佳的。只要有条带就说明转化没问题。菌落扩增本来就有很多影响因素，比如菌体成分的干扰，模板量等。另外你转表达菌前难道没对质粒进行鉴定？

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2楼2019-07-10 07:25:56
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五毛大肥猪

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by a112233a at 2019-07-10 08:04:40
亮度太小不可信 ，如果转化的好，应该非常亮

可是一般转表达宿主的重组质粒是构建好的，涂平板能长出来的不应该都是重组的吗？

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4楼2019-07-10 12:27:10
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五毛大肥猪

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by sannny at 2019-07-10 07:25:56
PCR无所谓条带亮度。亮度只能说明Pcr条件不是最佳的。只要有条带就说明转化没问题。菌落扩增本来就有很多影响因素，比如菌体成分的干扰，模板量等。另外你转表达菌前难道没对质粒进行鉴定？
...

转之前是验证过全正确了才转的 转了两次每次长出来的菌落PCR验证出来的条带都很淡

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5楼2019-07-10 15:20:32
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sannny

新虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 五毛大肥猪 at 2019-07-10 12:27:10
可是一般转表达宿主的重组质粒是构建好的，涂平板能长出来的不应该都是重组的吗？
...

是正常的。不放心送去测个序呗。表达菌可以测序的。

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6楼2019-07-10 17:53:47
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biosci

捐助贵宾 (职业作家)
换感受态细胞

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8楼2019-07-11 10:31:18
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五毛大肥猪

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by xinxiyuzhou at 2019-07-11 08:56:32
不正常，你的前期验证确定都是对的吗?导入DH5a后PCR结果呢？提的质粒验证了？然后如果前期验证都是对的，那你需要考虑你的BL21是否是BL21，找别人借一下或者自己再重新购买，表达菌株也不贵。还有，做PCR时做一个水 ...

我前期pcr、酶切、测序验证了才转的BL21的

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9楼2019-07-11 11:43:46
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xinxiyuzhou

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by 五毛大肥猪 at 2019-07-11 11:43:46
我前期pcr、酶切、测序验证了才转的BL21的
...

那就看你的BL21是不是你的BL21了，如果转进去了，PCR产物应该很亮的。
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10楼2019-07-11 13:12:49
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