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鲁班揍墨子

新虫 (初入文坛)

[求助] 克雷伯氏菌基因敲除一直失败已有2人参与

克雷伯氏菌敲除实验 最近一直失败

决明子_c5iz
从六月十五号到七月初,半个月的时间。用crispcas9敲除克雷伯氏菌的基因一直失败。

敲除步骤如下:

1.往lb培养基中加入kana抗生素,同时加入含有cas9质粒的克雷伯氏菌过夜培养

2.第二天转接二级种子,od等于0. 2时加入l型阿拉伯糖诱导 终浓度10mmol 培养到od等于0.4 ~0.6之间。放冰上半小时

3.四度离心,收集菌体。5000rpm 5min。用10%甘油洗三次,离心三次。

4.加入10%甘油1ml,吹打混匀,分装到1.5ml离心管。加入1000ng的donor片段和120ng的sgrna质粒。2500v 5ms电转,电转后立即加入lb培养基复苏。30度后培养1h离心收集涂布kana和spe双抗性板

5.第三天查看平板菌落生长情况 挑选单菌落进行pcr验证

当前存在问题:

4.收集菌体涂布平板 查看平板菌落生长情况时 发现一直糊板 未发现单菌落

已经更换阿拉伯糖 抗生素也重新配置 sgrna已经更换四对 实在想不出原因

@天使托 发自小木虫Android客户端
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prthefu

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

楼主你好,最近敲除做得怎么样。我现在也在弄一种菌的敲除。但是看你用的是CRISPR/Cas9技术,不是同源重组,我最近一直在查同源重组敲除,感觉方法上比CRISPR/Cas9要简单的多。所以,可以多交流啊。同源重组,理论上我都已经捋顺,就差实践了。
nothing is impossible in this world,if you have the will to win,you can achieve anything
2楼2019-08-19 18:42:26
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虾虾day

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

想请问一下后面找到是什么原因了吗?我敲了1个月了,急!!
3楼2020-07-01 00:40:34
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