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教授经验传授：打死也要掌握的6种细胞实验与方法描述！
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 6种常见细胞实验原理 一、细胞增殖 1. 细胞增殖的定义 细胞以分裂的方式进行增殖。单细胞生物，以细胞分裂的方式产生新的个体。多细胞生物，以细胞分裂的方式产生新的细 胞，用来补充体内衰老或死亡的细胞。  2. 细胞增殖的检测方法 ① 细胞代谢活性检测 （基于mtt、cck-8等） mtt（噻唑蓝）：通过添加四咪唑盐到细胞中可进行线粒体内酶代谢活性的测定。活细胞能将四咪唑盐（如mtt、xtt、wst-1）还原成蓝紫色的甲瓒或甲瓒盐（formazan），可通过分光光度计或酶标仪进行检测。 cell counting kit╟8 （cck-8）中的wst-8被细胞内脱氢酶生物还原后生成的橙色甲舎染料能够溶解在组织培养 基中，生成的甲舎量与活细胞数量成正比。基于cck-8（wst-8）的试剂盒能高度准确地检测细胞增殖，比mtt法 及xtt法的灵敏度高5倍，能检测更低的细胞数目。该试剂盒可适用于96孔板培养的贴壁或悬浮细胞。  ② dna的合成的检测 （基于brdu的免疫法或edu的点击化学法），可通过体内成像、微孔板或流式细胞术检测 等多种技术进行细胞示踪。 dna的新组装合成是细胞生长的必要条件，故经常被用来进行细胞增殖、细胞活力及凋亡的检测。brdu及edu，都是胸腺嘧啶的非放射性类似物，能掺入增殖细胞的dna中，可通过对brdu及edu的检测，从而对dna的合 成量进行测定。 edu（5-ethynyl-2’- deoxyuridine）是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶（t）渗 入正在复制的dna分子中，通过基于edu与apollo®荧光染料的特异性反应快速检测细胞dna复制活性，适用于细 胞增殖、细胞分化、生长与发育、dna修复、病毒复制、细胞标记示踪等方面的研究，尤其适合进行sirna、mirna、小分子化合物及其他药物的筛选实验。    二、细胞凋亡(apoptosis) 1. 细胞凋亡（apoptosis）的定义 细胞凋亡指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。 特点：细胞皱缩、体积缩小；部分细胞器、核糖体和核碎片被细胞膜包裹形成 凋亡小体，从细胞表面出芽脱 落，最后被具有吞噬功能的细胞吞噬；磷脂酰丝 氨酸外翻；细胞核染色质浓缩、边缘化、染色质dna断裂。 2. 细胞凋亡的检测方法 包括：caspase活性检测；dna片段化分析和检测；流式细胞术检测；膜变化检测（annexinv染色、膜 电位、线粒体功能完整性分析检测实验）及细胞形态学检测。 ① annexin v-fitc/pi双染法流式细胞术检测细胞凋亡 细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。利用这一特点，被检测细胞悬液 用荧光素染色，利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞核凋亡细胞。 annexin v可与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此annexin v被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。 碘化丙啶（propidium iodide, pi）能够透过凋亡中晚期的细胞和死细胞的细胞膜而使细胞核染红。因此将annexin v与pi匹配 使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。  ② 细胞形态学检测-荧光染色法（hoechst/dapi） 细胞形态的变化如胞膜皱摺或出泡、核染色质致密、胞质浓缩等，都可作为细胞凋亡的证据。一般以细胞核染色质的形 态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。dna 特异性染料有：ho 33342（hoechst 33342），ho 33258（hoechst 33258），dapi。三种染料与 dna 的结合都是非嵌入式的，主要结合在 dna 的 a-t 碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。 结果评判 Ⅰ 期：细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased）， 部分染色质出现浓缩状态； Ⅱa 期：细胞核的染色质高度凝聚、边缘化； Ⅱb 期：的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体 ③ tunel（原位缺口末端标记技术（in situ end labelling technique,isel)） 细胞凋亡中，染色体dna双链/单链断裂二产生大量的粘性3‘-oh末端，在细胞（或组织）结构保持不变的情况下，用荧 光素、地高辛或生物素标记的脱氧尿三磷酸（deoxyuridinetriphate，dutp)和末端脱氧核苷酸转移酶（tdt)相反应与凋亡细 胞裂解后3‘-oh端结合，经显色反应（细胞染成棕黄色）后检测dna裂解点的技术。  三、细胞自噬（autophagy） 1.细胞自噬的定义 自噬（autophagy）是普遍存在于真核细胞中的一种高度保守的代谢过程，是细胞内的一种“自食（self-eating）”现象。它作为细胞内的主要降解途径，将胞内物质运输到溶酶体内降解。 它主要有三 种形式：大自噬，小自噬和分子伴侣介导的自噬  2、细胞自噬检测方法 ① 自噬标志物（ lc3）检测 自噬形成时，胞浆型 lc3（即 lc3-i）会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即 lc3-ii），lc3-ii/i 比值的大小可 估计自噬水平的高低。lc3 这一转变过程可被 western blot 和荧光显微镜检测到，现已成为监测自噬体形成的推荐方法。在哺 乳动物中，lc3 包含 3 种亚型：lc3a、lc3b、lc3c，分布在不同的组织中，因此需要用不同的抗体去鉴定这3种亚型。 ② gfp-lc3 单荧光自噬指示体系 利用 lc3 在自噬形成过程中发生聚集的现象构建了 gfp-lc3 指示体系，无自噬时，gfp-lc3 融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成 时，gfp-lc3 融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通 过计数来评价自噬活性的高低。 ③ mrfp-gfp-lc3 双荧光自噬指示体系 mrfp-gfp-lc3 融合蛋白的病毒产品 mrfp 用于标记及追踪 lc3，gfp 的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体。 由于 gfp 荧光蛋白对酸性敏感(ph 敏感)，当自噬体与溶酶体融合后 gfp 荧光发生淬灭,而 mrfp 相对稳定，因此只能检测到红色荧光。 要点：细胞凋亡、自噬和坏死的区别 凋亡：细胞皱缩、体积缩小；部分细胞器、核糖体和核碎片被细胞膜包裹形成 凋亡小体，从细胞表面出芽脱落，最 后被具有吞噬功能的细胞吞噬；磷脂酰丝 氨酸外翻；细胞核染色质浓缩、边缘化、染色质dna断裂。 自噬：部分细胞器肿大，在细胞质中形成包裹细胞质内容物的双层膜囊泡结构 ，再与溶酶体结合实现内容物的降解。 坏死：细胞胀大，胞膜破裂，细胞内容物外溢，核变化较慢，dna降解不充分 ，引起局部严重的炎症。 四、细胞衰老（cell aging） 1. 细胞衰老的定义 细胞衰老是细胞周期调控下多基因参与的复杂的生理病理过程，是一种抑癌机制，也是生物衰老的潜在原 因之一.细胞衰老最显著的特征是细胞在很长一段时间内仍然维持代谢活性，但因阻滞于g1期，失去了对有丝 分裂原的反应能力和合成dna的能力，不能进入s期.衰老细胞有着显著的特性，衰老细胞细胞通常体积变大， 表达ph 6.0时有高酶活性的β-半乳糖苷酶。 2.细胞衰老的检测方法 ① β-半乳糖苷酶试剂盒检测 sa-β-gal试剂盒检测细胞衰老。以x-gal为底物，通过细胞内sa β-gal在酸性条件下稳定表达，催化底物生成蓝色 产物，表达sa-β-gal的细胞为阳性细胞，呈现蓝色，从而在光学显微镜下观察颜色变化以分析细胞的衰老状况。 仅对衰老细胞进行染色，不会染色衰老前的细胞（presenescent cells）、静止期细胞（quiescent cells）、永生 细胞（immortal cells）或肿瘤细胞。 ② western blot与qpcr检测衰老相关基因(p16、p21、p53、sirt1、pcna)表达。  ③ 流式细胞术（pi染色）检测细胞周期变化 细胞周期（cell cycle)：指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，通常由g0/g1期、s 期、g2期和m期组成。衰老的细胞阻滞于g1期，失去了对有丝分裂原的反应能力和合成dna的能力，不能进入s 期。 pi为插入性核酸荧光染料，能选择性的嵌入核酸dna和rna双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与 dna的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的dna分布状态，从而计算出 各个期的百分含量。  五、细胞迁移和侵袭 1. 细胞迁移和侵袭的定义 ①侵袭：肿瘤细胞向器官表面靠拢→肿瘤细胞用伪足贴在表面与内皮细胞粘连→肿瘤细胞用伪足从细胞的天然间隙 到达基底层→肿瘤细胞深入器官深部→形成癌巢搜索 ②转移：肿瘤细胞离开原发瘤，侵入淋巴管（或血管）→肿瘤细胞在淋巴管（或血管）内运行→肿瘤细胞从管中出 来，再转移到其他淋巴结（或毛细血管）中→到达其他组织或器官 2.细胞迁移和侵袭的检测方法 ① 细胞划痕检测细胞迁移 细胞划痕是一种简单易行的检测细胞运动的方法，实验成本低，可以用来检测贴壁生长肿瘤细胞的侵袭转移能力。 注意事项：一般做划痕实验，都是在无血清或者低血清状态下培养的，否则细胞增殖就不能忽略。 按照6孔板背后画线的垂直方向划痕，可以形成若干交叉点，作为固定的检测点，这就解决了前后观察时位置不固 定的问题。  ② transwell检测细胞迁移和侵袭 细胞迁移与侵袭实验将transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸 酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞， 应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研 究。侵袭实验需铺matrigel，而迁移实验不需要。  六、肿瘤血管形成 1. 肿瘤血管生成的定义 血管生成是肿瘤发生过程中新血管的形成。它是指源于已存在的毛细血管和毛细血管后微静脉的新的毛 细血管性血管的生长。肿瘤血管生成是一个极其复杂的过程，一般包括包括血管内皮基质降解、内皮细胞移 行、内皮细胞增殖、内皮细胞管道化分支形成血管环和形成新的基底膜等步骤。 2.体外管形成实验方法  最后给大家提供了6种细胞实验与方法描述的相关资源及课程： （一）细胞技术实验视频+教材 （二）细胞培养、细胞流式技术和tunel教程 （三）《干细胞分离培养与纯化技术》相关实验技术 （四）名师巧讲细胞生物学视频 （五）细胞培养大全 （六）【整理总结】细胞培养实验技术大全 、、、 |
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2019-06-30 09:19:57, 6.36 M
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