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fast-rui

新虫 (小有名气)

[交流] 异源表达蛋白遇到问题已有8人参与

本人最近在做异源表达,用的pet28a表达载体,宿主菌是BL21,od摇到0.6-0.8,16℃诱导19h,做了几次蛋白大部分都在包涵体中,iptg浓度试过0.1-0.8mM的。这次打算试试培养基多调几个ph试试。
但是想问就是我的蛋白等电点是6.74,LB的ph会影响表达吗?破碎的时候蛋白裂解液的ph设为多少比较合适?有没有大神可以给我点建议,看看能不能把包涵体减少。

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biosci

捐助贵宾 (职业作家)



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换融合蛋白表达试试

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2楼2019-06-11 21:03:08
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶


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对于在温度稍高容易形成包涵体的蛋白质,摇到od以后要等菌液冷却一点再加iptg,因为包涵体的形成有可能形成惯性,一旦开始形成,扭转需要时间。如果不容易形成包涵体的蛋白质,不必降温再诱导。

用BL21容易形成包涵体,用大肠杆菌的其它菌株只能是改善,不会根治,因为同一个物种的折叠系统大同小异。换宿主可能要换物种。

加一段融合蛋白质可能改善但不一定根治,而且不能确定会不会对蛋白质的本身性质有改变。具体要什么样的性质或可以接受什么样的性质,问你导师。

复性不一定可行,因为不一定能完全复性,而且即使部分复性形成可溶蛋白质,其性质也不一定与正确折叠得到的蛋白质性质一致。具体要什么样的性质或可以接受什么样的性质,问你导师。

你把长得快的菌液拿出来放在室温下短时间不会影响菌体状态,最多就是因为接触氧气不足造成生长缓慢。要是你担心,就放在温度稍低的摇床继续摇,大肠杆菌在28度的生长温度约为37度下八分之一。

要是还有能够维持更低温度的摇床,就继续降低温度。大肠杆菌在iptg存在时不会完全停止生长,但在这么低的温度下就更慢。OD600为1.5时诱导,10度。

很低温度时,摇床压力大,或直接走极端,放在4度冰箱时不时拿起来摇一摇。
流星来时我许了个愿,愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜素论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具,久不看论坛一来就提问者,宁弃EPI和VIP也不回帖。
15楼2019-06-14 00:40:45
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kindermoon

木虫 (小有名气)


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增加可溶性表达可以等OD600大一点比如1.0以上再加IPTG诱导,诱导时间一般2-3小时其实就够了。温度25度或者16度都可以。还是不行的话只能复性(后期处理麻烦还未必能复性成功)或者换别的工程菌试试。如果有少量可溶性的就可以了,大不了多摇几次的事。
16楼2019-06-14 13:40:23
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普通回帖

小太阳2017

新虫 (小有名气)


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裂解液调成8吧,LB的ph觉得影响不大,

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3楼2019-06-11 22:22:47
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fast-rui

新虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 小太阳2017 at 2019-06-11 22:22:47
裂解液调成8吧,LB的ph觉得影响不大,

好滴,谢谢

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4楼2019-06-11 22:44:34
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fast-rui

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by biosci at 2019-06-11 21:03:08
换融合蛋白表达试试

好滴,谢谢,我去看下相关的资料

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5楼2019-06-11 22:45:04
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shuiyuan003

新虫 (正式写手)


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好像是温度影响是包涵体还是可溶性表达

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6楼2019-06-12 01:13:04
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a336688

木虫 (小有名气)

追梦


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iptg浓度用0.1mM,诱导时机再早一点,还不行换宿主菌。。。跟pH没啥关系
7楼2019-06-12 08:33:18
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张凡云

铁杆木虫 (著名写手)


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两个方案,用pGEX4T-1这样的融合表达系统,二是用rosetta这样的宿主菌

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8楼2019-06-12 09:20:44
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fast-rui

新虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by a336688 at 2019-06-12 08:33:18
iptg浓度用0.1mM,诱导时机再早一点,还不行换宿主菌。。。跟pH没啥关系

诱导时机早一点是啥意思呀,是诱导时间短一点还是摇到od赶紧诱导??

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9楼2019-06-12 10:08:00
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fast-rui

新虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by shuiyuan003 at 2019-06-12 01:13:04
好像是温度影响是包涵体还是可溶性表达

嗯嗯是的,温度的影响还是很大的

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10楼2019-06-12 10:08:49
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