24小时热门版块排行榜     意得辑减200再送200,券码MUCH200

查看: 900  |  回复: 18

fast-rui

新虫 (小有名气)

[交流] 异源表达蛋白遇到问题已有8人参与

本人最近在做异源表达,用的pet28a表达载体,宿主菌是BL21,od摇到0.6-0.8,16℃诱导19h,做了几次蛋白大部分都在包涵体中,iptg浓度试过0.1-0.8mM的。这次打算试试培养基多调几个ph试试。
但是想问就是我的蛋白等电点是6.74,LB的ph会影响表达吗?破碎的时候蛋白裂解液的ph设为多少比较合适?有没有大神可以给我点建议,看看能不能把包涵体减少。

发自小木虫IOS客户端
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

biosci

捐助贵宾 (著名写手)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
换融合蛋白表达试试

发自小木虫Android客户端
2楼2019-06-11 21:03:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
对于在温度稍高容易形成包涵体的蛋白质,摇到od以后要等菌液冷却一点再加iptg,因为包涵体的形成有可能形成惯性,一旦开始形成,扭转需要时间。如果不容易形成包涵体的蛋白质,不必降温再诱导。

用BL21容易形成包涵体,用大肠杆菌的其它菌株只能是改善,不会根治,因为同一个物种的折叠系统大同小异。换宿主可能要换物种。

加一段融合蛋白质可能改善但不一定根治,而且不能确定会不会对蛋白质的本身性质有改变。具体要什么样的性质或可以接受什么样的性质,问你导师。

复性不一定可行,因为不一定能完全复性,而且即使部分复性形成可溶蛋白质,其性质也不一定与正确折叠得到的蛋白质性质一致。具体要什么样的性质或可以接受什么样的性质,问你导师。

你把长得快的菌液拿出来放在室温下短时间不会影响菌体状态,最多就是因为接触氧气不足造成生长缓慢。要是你担心,就放在温度稍低的摇床继续摇,大肠杆菌在28度的生长温度约为37度下八分之一。

要是还有能够维持更低温度的摇床,就继续降低温度。大肠杆菌在iptg存在时不会完全停止生长,但在这么低的温度下就更慢。OD600为1.5时诱导,10度。

很低温度时,摇床压力大,或直接走极端,放在4度冰箱时不时拿起来摇一摇。
流星来时我许了个愿,愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜素论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具,久不看论坛一来就提问者,宁弃EPI和VIP也不回帖。
15楼2019-06-14 00:40:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kindermoon

木虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
增加可溶性表达可以等OD600大一点比如1.0以上再加IPTG诱导,诱导时间一般2-3小时其实就够了。温度25度或者16度都可以。还是不行的话只能复性(后期处理麻烦还未必能复性成功)或者换别的工程菌试试。如果有少量可溶性的就可以了,大不了多摇几次的事。
16楼2019-06-14 13:40:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

小太阳2017

新虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
裂解液调成8吧,LB的ph觉得影响不大,

发自小木虫Android客户端
3楼2019-06-11 22:22:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

fast-rui

新虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 小太阳2017 at 2019-06-11 22:22:47
裂解液调成8吧,LB的ph觉得影响不大,

好滴,谢谢

发自小木虫IOS客户端
4楼2019-06-11 22:44:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

fast-rui

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by biosci at 2019-06-11 21:03:08
换融合蛋白表达试试

好滴,谢谢,我去看下相关的资料

发自小木虫IOS客户端
5楼2019-06-11 22:45:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shuiyuan003

新虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
好像是温度影响是包涵体还是可溶性表达

发自小木虫Android客户端
6楼2019-06-12 01:13:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

a336688

木虫 (小有名气)

追梦



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
iptg浓度用0.1mM,诱导时机再早一点,还不行换宿主菌。。。跟pH没啥关系
7楼2019-06-12 08:33:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

张凡云

铁杆木虫 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
两个方案,用pGEX4T-1这样的融合表达系统,二是用rosetta这样的宿主菌

发自小木虫Android客户端
8楼2019-06-12 09:20:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

fast-rui

新虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by a336688 at 2019-06-12 08:33:18
iptg浓度用0.1mM,诱导时机再早一点,还不行换宿主菌。。。跟pH没啥关系

诱导时机早一点是啥意思呀,是诱导时间短一点还是摇到od赶紧诱导??

发自小木虫IOS客户端
9楼2019-06-12 10:08:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

fast-rui

新虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by shuiyuan003 at 2019-06-12 01:13:04
好像是温度影响是包涵体还是可溶性表达

嗯嗯是的,温度的影响还是很大的

发自小木虫IOS客户端
10楼2019-06-12 10:08:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 fast-rui 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[版块工场] 【早起签到贴】2019年7月19日(q q 48626260 进群申请:小木虫——您个人ID) +33 8475 2019-07-19 33/1650 2019-07-19 13:13 by tintin2005
[职场人生] 自己研究方向不是单位主流方向 +6 lizilucky 2019-07-17 12/600 2019-07-19 11:28 by lizilucky
[论文投稿] 论文接收,报喜 +21 海上的小船 2019-07-18 22/1100 2019-07-19 11:21 by 2574244188
[留学生活] 再见,青春。美国,我来了。 +32 游子未归 2019-07-16 39/1950 2019-07-19 07:43 by 其义自见1
[考博] 求西安交大能动学院考博资料,考哪些科目 +3 只一眼便万年 2019-07-17 9/450 2019-07-18 17:02 by 只一眼便万年
[基金申请] 关于FS01/FS02/2019/2019(2) +3 tangme1 2019-07-18 3/150 2019-07-18 15:12 by Coolly
[有机交流] 关于低沸点醇的合成后处理 +4 zhongyifan 2019-07-17 4/200 2019-07-18 13:22 by 9号77
[留学DIY] 记录DIY历程 +6 糯米12345 2019-07-17 13/650 2019-07-18 08:04 by lpf19891022
[硕博家园] 星光不问赶路人 +8 hy19950429 2019-07-18 9/450 2019-07-18 07:53 by 张小生子
[基金申请] 5cc8, fs01, 201902 +31 410088 2019-07-17 36/1800 2019-07-17 23:21 by levinzhwen
[基金申请] 有没有已知fs02能中的? +18 Abc321 2019-07-13 21/1050 2019-07-17 18:00 by darkwhale
[论文投稿] 文章篇幅太长 怎么解决 +3 lancelance 2019-07-16 5/250 2019-07-17 06:24 by cyh_crl
[基金申请] 系统维护过后 +10 dedelan 2019-07-16 12/600 2019-07-16 18:37 by 392816
[论文投稿] 论文投稿求助 +3 buwu 2019-07-15 3/150 2019-07-16 08:14 by bobvan
[硕博家园] 关于硕士期间的成果问题 +7 442861228 2019-07-15 12/600 2019-07-15 15:26 by vincent_hpax
[公派出国] 关于党员组织关系转移 +9 imahuan 2019-07-12 15/750 2019-07-15 09:57 by 秦语竹影
[基金申请] 信息口面地青开始没有 +13 lanzhongzhou 2019-07-12 17/850 2019-07-13 20:30 by lanzhongzhou
[考研] 越想越睡不着 +11 从没考过研 2019-07-13 15/750 2019-07-13 14:47 by 洋葱科学
[基金申请] 青年基金第二年,还没消息,焦急等待。希望能中。。。 +7 许可yz 2019-07-13 10/500 2019-07-13 12:17 by mycaas
[基金申请] 信息四处的大佬帮我看看去年的青基上会了没有 +5 lanzhongzhou 2019-07-12 12/600 2019-07-13 11:08 by forest_wong
信息提示
请填处理意见