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新虫 (初入文坛)

[交流] 养细胞,做WB不注意支原体污染?一开始你就输了!

台湾著名漫画家几米曾说过,人们总是仰望和羡慕着别人的幸福。这句话也适用于做科研的:隔壁实验室的老师那么开明,暑假可以放心休假,而自己的导师要求暑假还得加把劲做实验;自己做的研究,用到已有报道中的例证时,明明其他人能重复出,而我这个倒霉鬼怎么都做不出。是我天生不是这块科研料,还是没找对方法?

当实验结果与预期不一致或无法重复时,先自查——查一下自己的研究样本,特别是细胞培养是否做到位了,其中有“一点”需特别注意,因显微镜下很难观察到它,没有视觉,就没有感知,所以它很容易被忽略。

这“一点”就是:支!原!体!

全世界范围内,不同实验室的科研人员在培养细胞时,发生支原体污染的概率是10%-85%不等【1】。支原体是最小的原核生物,大约0.2-0.3um, 可以透过滤膜(0.22-0.45 um),因此被污染细胞常常肉眼观察不到,一般通过细胞核染色在显微镜下可看到如下现象(a 无污染;b、c 有支原体污染)(图1,见附件图片)。


图1 细胞荧光染色后镜检支原体

大量文献报道细胞支原体污染后,会影响dna 、rna 和蛋白的表达,进而会产生以下几个方面的影响【2,3】。
细胞生长和繁殖
细胞代谢及功能
染色体异常
免疫细胞的质量

▼更详细的关于支原体污染的影响可见以下列表(表1👇)【3】
general effects on eukaryotic cells:
-altered levels of protein, rna and dna synthesis
-alteration of cellular metabolism
-induction of chromosomal aberrations (numerical and structural alterations)
-change in cell membrane composition (surface antigen and receptor expression)
-alteration of cellular morphology
-induction (or inhibition) of lymphocyte activation
-induction (or suppression) of cytokine expression
-increase (or decrease) of virus propagation
-interference with various biochemical and biological assays
-influence on signal transduction
-promotion of cellular transformation
-alteration of proliferation characteristics (growth, viability)
-total culture degeneration and loss

specific effects on hybridomas:
-inhibition of cell fusion
-influence on selection of fusion products
-interference in screening of monoclonal antibody reactivity
-monoclonal antibody against mycoplasma instead of target antigen
-reduced yield of monoclonal antibody
-conservation of hybridoma

表1 细胞培养中支原体污染的影响(来自参考文献3)

实例——看看支原体影响有多大!

2003年,crispin j. miller等人【4】在支原体污染的mcf7细胞中通过生物芯片技术,证实了大量基因的表达发生了变化,支原体污染不仅改变了许多细胞因子的表达,还改变了应激反应基因、转运蛋白、受体、离子通道、生长因子、氧化酶、肿瘤抑制基因和癌基因的表达 (图2,见附件图片)。

图2 microarray分析支原体污染和未污染的mcf7细胞中mrna 水平的变化情况◎ a.与未污染的细胞相比较,支原体污染细胞基因表达水平的平均变化(用紫色小圈表示),变化显著大于2倍的基因用橘色小圈表示;b. go分析归类图2a中的基因的功能

上述这篇文章是通过高通量的方法来证明支原体污染对培养细胞中基因和功能的影响,我们再来看一篇更具体的文章。

ekaterina zakharova 等【5】研究了在支原体污染的thp-1细胞中,由pmaps刺激的促炎症反应中一系列基因的表达变化。首先,支原体污染影响tlr4、il1r2和il10等基因表达;进一步, lps刺激的支原体阳性thp-1细胞表现出tlr4、il1r2和il10等常规炎症反应基因显著抑制(图3,见附件图片)。

图3 lps或f. novicida刺激thp-1支原体阴性和阳性细胞中各基因表达

表达影响更显著的还有myd88、nfkbiz、nfkbia、casp1、tnf、il-6基因。支原体阴性和阳性thp-1细胞在tlr2、rela和irak1基因表达上无差异。正是由于有些基因的表达影响不突出,即使细胞出现支原体污染也不会被察觉。所以,当我们碰到一条信号通路中的上下游基因的表达都符合假设,但是其中一个蛋白表达异常时,第一反应是看看细胞有没有发生支原体污染。这里,我还要特别提醒研究一系列白介素因子的同学,常有同学说,“我用的细胞和文献上是一样的,也用 lps 诱导,但是就是检测不到il-1表达”,那么,这种情况下就要考虑支原体污染了。

再来看一篇更加直观的文章,haitianzhao 等人【6】直接检测了支原体污染下amyloid-beta (aβ) 的表达,从图中(图4,见附件图片)我们看到,在支原体污染3小时的细胞中,aβ完全降解。可见,支原体的污染真的很可怕,有没有? 支原体污染不仅对肿瘤、炎症相关细胞影响极大,连阿尔茨海默症重要生物标记基因也无所遁形。

如何与这害人的小妖精做斗争?

首先,可对细胞进行支原体污染检测。

01,最简单的就是自己设计引物,吸取5-10ul左右的培养基,做pcr。 若有污染,会p出条带。以下图片是小编还在实验室时做此检测的结果,记得那会实验室每周有专人进行全实验室细胞的支原体检测,一发现有问题,马上将其扼杀在摇篮里。如图(图5,见附件图片)中编号2-8 和3-7就是有支原体污染的细胞,需弃之。总言之,这种方法非常有用,你们的实验室也可以效仿起来哦。

图5 支原体pcr 检测结果

02,hoechst等荧光染色法和酶活法。hoechst等荧光染色法需要先将细胞种植在载玻片上,等细胞长到合适的密度,对其进行固定、洗涤、染色等,最终在显微镜下的现象可参照上文中图1。酶活法是通过检测支原体特异性atp合成酶来检测支原体的污染,需要特定的试剂盒和相应的多功能酶标仪,而且试剂盒的价格还比较昂贵。这两种方法没有做pcr 来得简单快速。

03,如果您是用cst 的抗体去检测蛋白的表达,小编再推荐一种方法,就是向cst申请阳性对照,因为这些样本都是来自于无任何污染的细胞裂解物,可作为实验参照。点击此处即可申请cst阳性对照。

然后,如果检测到有支原体污染,该如何处理呢?

01,方法1. 简单粗暴,直接扔掉,重新复苏细胞。如果还没做处理,还是赶紧弃之吧,抢救不如重新复苏了,另外对培养箱要做由里至外的清洁处理。但如果你培养的细胞比较珍贵,直接丢弃可惜,那么在确定对细胞的基因及蛋白表达没有影响的情况下,借助某些化合物如plasmocin来清除支原体。

02,方法2. 如图(图6,见附件图片)所示,可以清除支原体,但是比较麻烦,一般不推荐。

至此,我们已经很清楚这一点:支原体污染不易察觉,但染上却可以毁了全部细胞。

我们落得只能眼巴巴仰望“别人家”的实验,并且开始怀疑自己怀疑人生!说到头,都怪支原体这个坑货,让我们在起跑线上就被甩了一条街。

为了不让自己输在起跑线上,今后,请在蛋白检测不顺时,多注意下不易察觉的细节如支原体污染,细胞交叉污染,细胞传代次数过多所导致的细胞老化,等等。做科研,细节决定成败!

如果还想多了解支原体污染,小编还找到了以下文章,【7-9】可用来深入学习。

【参考文献】

1. olarerin-george ao. and hogenesch jb. 2015. assessing the prevalence of mycoplasma contamination in cell culture via a survey of ncbi’s rna-seq archive.nucleic acids research. (5):2535-42
2.  robinson lb. et al. 1956. contamination of human cell cultures by pleuropneumonia like organisms. science.124(3232):1147-8
3. hans g. drexler and cord c. uphoff. 2002. mycoplasma contamination of cell cultures: incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. cytotechnology.39: 75╟90.
4.crispin j. miller, heba s. kassem, et al. 2003. mycoplasma infection significantly alters microarray gene expression profiles. biotechniques. 35:812-814.
5. ekaterina zakharova, jaykumar grandhi et al . 2010. mycoplasma suppression of thp-1 cell tlr responses is corrected with antibiotics. plos one.5 (3) : e9900
6.haitian zhao, ute dreses-werringloer ,et al. 2008. amyloid-beta peptide degradation in cell cultures by mycoplasma contaminants. bmc research notes . 1:38
7. stephen demczuks, christophe baumber, et al. 1988. differential effects of in vitro mycoplasma infection on interleukin-l a and β mrna expression in u937 and a431 cells. the journal of biological of chemistry. 263(26),13039-13045.
8. esther elkind, hagai rechnitzer, et al. 2010. mycoplasma hyorhinis upregulates calpastatin and inhibits calpain-dependent proteolysis in sh-sy5yneuroblastoma cells. fems microbiol lett. 304: 62╟68
9. dy logunov, dv scheblyakov, et al. 2008. mycoplasma infection suppresses p53, activates nf-κb and cooperates with oncogenic ras in rodent fibroblast transformation. oncogene. 27(33): 4521╟4531.


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