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转载----无缝克隆，让载体构建变得像搭积木一样简单
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前言 提起“克隆”、“载体构建”这两个词，似乎总会同时提到“限制性内切酶”。没错，在过去数十年，用限制性内切酶产生黏性末端，并通过碱基互补配对，连接两个甚至更多片段的克隆方法，是载体构建的经典方案。 近年来，“无缝克隆”逐渐受到科学家的欢迎。相比之下，无缝克隆操作更加简单，灵活性更强，同时几乎不受序列的限制，一次可定向组装高达10个片段的dsdna。这篇文章将带大家认识无缝克隆的原理、优势和应用。 一、无缝克隆的原理 首先要强调的是，无缝克隆有两个主要的流派：gibson assembly和golden gate assembly。由于golden gate assembly依赖于type iis限制性dna内切酶（如bsai，bbsi等），一旦载体不携带相应的识别序列，这种方法就走不通了。而假设通过pcr引入type iis内切酶识别序列，那便不是真正意义上的“无缝”了。因此本文所提的“无缝克隆”，特指gibson assembly流，不涉及任何golden gate及其他流派。 目前，无缝克隆比较著名的商品化名字有neb家的gibson assembly和nebuilder hifi dna assembly，clontech家的in-fusion，以及invitrogen家的geneart等。但无论叫什么名字，其基本原理都和早期的gibson assembly的是一样的。 与传统的双酶切克隆一般，无缝克隆同样需要依赖于dsdna的黏性末端进行互补配对，并利用dna连接酶催化形成磷酸二酯键修复缺口（nick）。但是，无缝克隆并不使用“内切酶”来制造黏性末端，而是通过“外切酶”来产生的。 （tips 1：“内切酶”是在核酸链内部进行“一刀两断”剪切的酶，而“外切酶”是在核酸链的末端、即外部进行“逐个碱基”剪切的酶） 在无缝克隆中使用的外切酶是t5核酸外切酶，它能沿着5’→3’方向，降解dsdna，从而产生黏性末端。 （tips 2：t5外切酶同时具有ssdna外切酶活性，但并不降解超螺旋dsdna。） 读到这里大家应该能想到，假设要拼接的两个片段的末端，是一模一样的碱基序列，那么通过t5外切酶，就能产生几乎一致的黏性末端了。没错，无缝克隆的原理便是如此。如下图所示，假如我们需要将3个片段按照1→2→3的顺序拼接起来，只需要保证1的末尾和2的开头，以及2的末尾和3的开头，具有同样的序列即可（我们可称之为同源臂）。这个同源臂序列，并不是额外添加进去的，而是载体或者拼接片段本身携带的。也就是说，我们可以通过pcr的方法，在外源拼接片段的两端加上线性化载体的序列即可。  1.jpg 但是，t5外切酶并不能保证将每一个片段的5’末端都降解成一样长的黏性末端，退火之后，极可能存在缺失的碱基。这时候，就需要借助dna聚合酶，也就是我们平时用于pcr扩增的酶进行修复。最后一步，便是借助taq dna连接酶，催化形成磷酸二酯键，将所有缺口补齐。 有心的读者会发现，假设t5外切酶一直降解dsdna的5’末端，岂不是最终会将其变成ssdna？这样如何进行下游的拼接？难道仅仅依靠dna聚合酶的5’→3’合成双链的反应与之竞争？ 无缝克隆的另一高明之处，就是利用高温。t5外切酶的最适温度是37℃，然而无缝克隆是在50℃下进行的，加之添加的酶单位较少，因此整个反应体系很快便会失去外切的活性，而dna聚合酶的活性得以维持。而为了保证dna连接反应顺利进行，无缝克隆采用的是热稳定的taq dna连接酶，而非传统的t4 dna连接酶。同时，为了保证黏性末端能够在50℃下进行互补配对，同源臂的长度一般>15 bp。 二、无缝克隆的优势 不受片段序列的限制、实现任意组装，是无缝克隆的最大优势。 传统的酶切克隆，需要克隆载体的多克隆位点携带可用的单一酶切位点。假如这些酶切位点在外源片段之中同时存在，克隆就会受到限制。而无缝克隆不依赖于限制性内切酶，仅靠同源臂进行互补配对。因此每次进行片段拼接时，仅需通过引物制作同源臂，而不需要像以往一般仔细地检查pcr出来的外源片段内部是否同时会被内切酶消化。与此同时，我们也不再需要购买各式各样的内切酶，只要一个试剂盒就可解决所有克隆实验。 无缝克隆第二个优点是可以同时无缝地拼接多个片段。传统的酶切克隆，由于酶切位点有限，我们能组装的片段数量是有限的。同时，由于酶切位点之间存在着一定的空间距离，片段与片段之间不可避免地会产生间隔，或者说“缝隙”。此外，酶切克隆通常一次只能拼接2-3个片段。随着拼接片段的增多，传统方案的效率会急剧降低，通常只能分多次拼接。 （tips 3：过去有一种提高酶切连接多片段的方法，是在连接后，在载体和外源片段的边界上设计引物，进行一轮pcr，扩出全长连接产物，跑胶纯化后再进行二次连接。然而这种方法耗时耗力，且长片段的pcr容易突变或失败，同时pcr的引物还引入了更多的无意义序列。） 而无缝克隆可轻松拼接4-5个片段，最高可达10个，而且只需要将所有片段混在一个管子里，进行一步反应。 节省时间，是无缝克隆的第三个优势。传统的酶切克隆，首先需要进行pcr，胶回收，然后酶切载体和外源片段，再过柱纯化，随后连接，最后转化。而如果需要进行多片段组装，部分步骤还需重复几轮。每多一个片段，可能要多花费三天到一周的实验时间。而无缝克隆仅需pcr和胶回收，随后即可直接进行多片段拼接。拼接10个片段所花的时间，跟拼接2个片段的几乎是一样短的。  2.jpg 三、应用举例 例一：无缝克隆在crispr中的应用。 crispr介导的基因敲除依赖于cas9等内切酶，以及帮助内切酶定位到指定位点的grna。在一个细胞系中同时敲除多个基因，虽可以通过转染多个grna表达载体来实现，但这种方案存在随机性，并不能保证每个细胞都能获得所有的grna载体。而通过无缝克隆，我们可将多个u6启动子和grna序列（包括spacer和scaffold）元件串联起来，实现一个质粒表达多个grna。 （tips 4：目前还有其他多种multiplex crispr的方案，各有优缺点。请自行查阅文献，本文不赘述。） 基因定点敲入（knock-in），需要在打靶区域dna产生双链断裂，并以含有上下游两段同源臂外加插入基因序列的供体作为修复模板，实现外源序列的插入。简而言之，供体质粒需要含有5’同源臂 + 插入序列 + 3’同源臂，以及基本质粒骨架（含有ori、抗性基因等基本元件，方便生产供体质粒）共计4个部分构成（见下图）。通过无缝克隆，我们可以轻松地将这4部分片段通过一步反应拼接出来。  3.jpg 例二：用无缝克隆构建多顺反子表达载体。 将egfrviii基因、p2a多顺反子元件、irfp720基因拼接到plvx-tetone载体中（如下图），实现tet-on诱导表达egfrviii基因，同时还能表达irfp720基因，用于小动物活体荧光成像。 （tips 5：有关多顺反子元件的介绍，请阅读本专栏的另一篇文章 多顺反子表达元件——一次满足你n个愿望）  4.jpg 假如使用双酶切克隆，你会发现，只有agei和bstz17i酶切位点可用于egfrviii基因克隆，因为另外两个酶切位点同时存在于该基因内部。而p2a元件和irfp720基因必须和egfrviii基因处于同一个读码框，我们没有办法使用agei进行后续的克隆了。 本司机的做法是，直接用pcr构建出各个部件，然后通过无缝克隆一步组装。这几个部件分别是： 1、plvx-tetone载体的一半； 2、plvx-tetone载体的另一半； 3、egfrviii； 4、p2a + irfp720。 将plvx-tetone通过pcr拆成两半的原因是：质粒超过8 kb，直接通过pcr线性化整个质粒的突变几率，比扩增两个4 kb的片段要略高一些。同时，由于两个4 kb片段在跑琼脂糖时，可以和8 kb的环状pcr模板区分开来，因此可以直接切胶回收，而不需预先进行dpni去除环状质粒，即可实现零背景的转化。 （tips 6：线性化质粒也可以通过单酶切或双酶切来实现。） p2a元件非常短，仅有66 bp，很可能被t5外切酶彻底降解。不过，我们只需通过两轮pcr，在扩增irfp720基因的上游引物的5’端引入部分p2a序列（每次引入33个碱基），即可获得p2a + irfp部件。 （tips 7：有关无缝克隆的引物设计，可直接使用所购试剂盒厂家的线上工具。我个人比较喜欢用nebuilder hifi dna assembly，传送门 nebuilder assembly tool。使用之前，可以用word等文本编辑软件，将所要拼接的序列按5’→3’依次排好，用不同颜色区分标注，然后再挨个粘贴到线上设计工具中即可。此外，该试剂盒似乎通过调整酶浓度和buffer的离子浓度，克服了t5外切酶对ssdna的活性，从而可以用ssdna oligo桥接任何dsdna片段。具体内容请参考neb公司的宣传页面。） 四、目前存在的问题 吹了半天，无缝克隆其实也不是完美的。细心的读者可能已经发现，前面提到，p2a太短无法直接拼接。是的，无缝克隆目前无法组装小片段，因其可能会被t5外切酶彻底降解。addgene blog指出，用于gibson assembly的片段最好不低于200 bp，而neb官方的线上设计软件，强制输入片段的长度必须大于75 bp，并提示最好不低于110 bp。 （注：nebuilder试剂盒号称可用短至60 nt的单链oligo桥接两个dsdna，或者在桥接的同时在两者之间引入短片段，而其他试剂盒做不到，具体机制正如前文所提的t5外切酶对ssdna的活性。但本人并未亲测是否真实可靠。） 其次，由于无缝克隆依然依赖于前后两条同源臂黏性末端的互补配对，假设黏性末端内部恰好形成了稳定的二级结构（如发夹结构），无缝克隆的效率便会显著降低。虽然这只是个概率的问题，但万一实验失败，在洗完脸后，不妨检查一下同源臂及临近序列会不会产生稳定的二级结构。（注意：反应温度是50℃，也不算低了，通常只有脸太脏的时候才会这么倒霉。） 最后，无缝克隆中所使用的连接酶，是有所谓的“保真性”的。dna连接酶所实现的功能，是催化形成磷酸二酯键，将两个脱氧核苷酸连接起来。这同时也意味着，我们并不希望见到，含有错配互补序列的片段，也被连接起来。经典酶切克隆法使用的是保真度低、即对错配容忍度极高的t4 dna连接酶。但由于酶切克隆所产生的黏性末端是完全一致的，因此基本不可能出现问题。而无缝克隆虽然借助了序列完全一致的同源臂，但t5外切酶并不能保证仅消化同源臂的部分。再加上在互补配对时，长链黏性末端极易随机产生不完美的配对，因此导致拼接错误。dna连接酶的保真度，是由酶的类型，以及反应条件（温度、缓冲液ph、盐强度等）决定的。不同无缝克隆试剂盒的厂家，可能有不同的配方，至于哪个最适合你，就只能靠自己摸索了。而至于dna聚合酶的保真性，由于需要合成的碱基数少，并非传统的pcr应用，因此一般不会在这个环节翻车。另外还给大家推荐一个载体构建的课程，最近我自己也在看，大家可以自己在附件里自行查看。转自知乎-吴思涵 [ Last edited by 渊博震天 on 2019-5-19 at 21:32 ] |
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2019-05-14 14:47:40, 67.18 K
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