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[交流]
抗体偶联与修饰
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抗体与蛋白质或者微粒的偶联对于生命科学研究、医疗诊断和治疗是极为重要的。抗体偶联已经成为癌症和其他疾病定向治疗的一类重要的生物试剂。 实际上，在肿瘤细胞上已经鉴定出几十种标记物，这些标记物的单克隆抗体已被开发用于肿瘤的靶向治疗。抗体偶联物的制备及其在体内对癌细胞的杀伤作用已成为当前研究新药的主要策略之一。在大多数情况下，位点特异性给药涉及到成功开发单克隆抗体偶联物，该偶联物可以靶向病变细胞而不影响正常细胞。 此外抗体在免疫分析和检测技术上的使用，形成了广泛的应用，以至于影响了每个领域的研究。 相对廉价的多克隆抗体和单克隆抗体，具有严格的特异性，使得能够与任何可识别的分析物进行高亲和力的相互作用的试剂体系的设计成为可能。纯化后免疫球蛋白的定向特异性为免疫分析试剂提供了强大的工具。通过使用一些偶联和修饰方法来优化特异性抗体，使其在复杂的混合物中更容易追踪。例如，用酶、荧光复合物和生物素标记抗体，标记物提供了可量化和直观的检测结果。 为了维持抗血清衍生的抗体偶联物的特异性，只用使用亲和纯化的免疫球蛋白可以使用。 采用相应的固定化抗原，利用亲和层析法从抗血清中分离纯化出制剂。因此，制备的制剂只含有单一抗原特异性的抗体。应当避免对整个免疫球蛋白进行偶联和修饰，由于试剂中含有其他种类的抗体，导致试剂具有严重的非特异性活性。二抗应使用亲和纯化和高度交叉吸附抗其他物种抗体类型的免疫球蛋白，防止带来非特异性干扰。 单克隆抗体同样需要亲和层析法纯化，之后进行生物偶联。可以使用固定化的抗原纯化，抗原量不足的情况，可以使用固定化的免疫球蛋白结合蛋白（如蛋白A）。大多数单抗在经过纯化后仍保有活性，同时也足够稳定，可以经受化学修饰。然而有时，部分单抗见过修饰后活性会下降或者失活。有时，活性的降低是由于偶联时，抗原结合位点被阻塞。一些情况下，互补决定区构想的改变是导致问题的原因。如果仅仅是抗原结合位点被堵，选择合适的修饰位点，就能解决这个问题。另一方面，有些单抗，无论哪种偶联和化学修饰时都是不稳定的。当处理单克隆时，反复试验以确定修饰是否会严重影响活性是必要的。抗体分子独特的结构特点为修饰和偶联提供较多的选择方案(Roitt, 1977; Goding, 1986; Harlow and Lane, 1988a, b, c)。以最大程度保留抗体的抗原结合活性为目的，选择合适偶联过程。 最基本的免疫球蛋白G分子是由两个轻链和两个重链组成，通过非共价结合力和二硫键结合在一起。轻链CL和重链的CH1之间通过二硫键将两条链链接在一起。两条重链在铰链区（Hinge Region）通过二硫键连接在一起。免疫球蛋白分子中的两条重链是相同的。不同类别的免疫球蛋白具有不同的分子量，一般为50000-75000。同样，抗体的两个轻链是完全一样的，分子量大约为25000。对于IgG分子，分子量为四个亚基的总和，范围在150000-160000之间。 在已知的抗体中发现了两种轻链亚基，一个抗体分子中的轻链是λ或者κ中的一种，两种类型的轻链亚基不可能同时存在与一个抗体分子中。免疫球蛋白的种类取决于重链的类型，每个抗体分子只能含有一种类型的重链（γ、μ、α、ε、δ），因此有五种主要类型的抗体分子，分别为IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。其中IgG、IgE和IgD三种抗体具有基本的抗体结构，有两条轻链和两条重链组成。 相比之下，IgI可以以抗体基本结构的单分子、双分子和三分子的形态存在，而IgM以五聚体的形式存在。IgA和IgM都含有额外的一个亚基J链，分子量为15000的酸性多肽链，其富含糖类。免疫球蛋白的重链同样糖基化，特别是CH2区域和Fc片段，而且在抗原结合位点附近也可能含有多糖。 在Ig-type的抗体结构上存在两个抗原结合位点，有重链N端附近的可变区形成，在'Y'结构的顶端。由这些亚基形成的独特的三级结构产生了与抗原分子相互作用的所必须的构想。免疫球蛋白与抗原分子间相互作用的关键涉及到非共价结合力，是由于重链和轻链中的多个非顺序氨基酸完成。换句话说，结合位点的形成并不是严格按照每条链上线性氨基酸的顺序，而是氨基酸在三维空间独特的位置形成的。结合位点由于具有相应抗原结构互补性，因此具有特异性抗原亲和力，在其接触点上由于范德华力，离子键、疏水键和氢键的存在而结合在一起。 抗体分子的酶修饰衍生物可以保留相应的抗原结合位点。两种主要的抗体消化方式对于免疫诊断试剂研发是有益的。使用木瓜蛋白酶消化抗体后产生两个小的片段，Fab片段包括抗原结合位点，另外一个较大的片段是Fc片段包含两条重链的下半段。使用胃蛋白酶消化抗体后，产生一个大片段含有两个抗原结合位点（称为F(ab')片段），同时会降解Fc片段产生小的片段。F(ab')片段仍然被铰链区残留的二硫键连接在一起。通过2-mercaptoethylamine（MEA）或其他还原试剂破坏二硫键，产生两个Fab'片段，每个片段含有一个抗原结合位点，这样会导致Fab'片段的特异性降低。 抗体分子具有很多功能团，适合修饰和偶联。交联剂可以用来靶向赖氨酸的ε-氨基和N-端氨基。C-端的羧基、天冬氨酸和谷氨酸的羧基同样可以链接其他分子。虽然抗体分子中氨基和羧基像其他蛋白质中一样丰富，但在免疫球蛋白的三级结构中分布是均匀的。由于这个原因，偶联过程中利用这些官能团将会随机的交联到整个抗体分子。随机的偶联导致抗体在共轭结构的改变，经常导致阻塞抗原结合位点，不利于与其他蛋白或分子的结合。相比于未偶联的抗体，偶联后的抗体，阻塞了抗原结合位点，降低了抗原结合力。 如果化学偶联的官能团在抗体中有特定的数量，且离散分布在抗体上，通常会成功保留抗体的结合力。使用能够特异性识别免疫球蛋白表面特定位置的氨基酸残基的定向偶联交联试剂，通常可以选择原理抗原结合位点的氨基酸残基。通过对抗体结果的了解和选择正确的偶联过程，免疫球蛋白可以定向调整，同时保留了对抗原的结合能力。 在这方面，有两个定向化学反应是特别有用的。在铰链区链接两个重链的二硫键可以被还原剂（如MEA、DTT、和TCEP）特异性断裂，生成两个半抗体分子，分别含有一个抗原结合位点。更小的抗原结合片段可以利用胃蛋白酶消化抗体F(ab')2，随后使用同样的方法还原生成Fab'片段。这两种处理方法都暴露了巯基官能团，可以通过巯基反应探针和交联剂进行偶联。利用铰链区的-SH官能团偶联，可以使得偶联的蛋白或其他分子远离抗原结合位点，保证结合位点不被堵塞保留抗原结合活性。 抗体分子的第二种定点偶联方法是利用Fc片段上的CH2结构域上的多聚糖链，多聚糖的残基可以被过碘酸盐氧化生成醛基。含有酰肼基团的交联剂和修饰试剂可以靶向识别醛基，从而连接其他分子。这种方法可以使用完整的抗体分子，避免了抗原结合位点被堵塞，在偶联后能使抗原结合活性得到最大程度的保留。但是，使用这种方法是应注意，在抗原结合位点附近的区域会被糖基化，可能会影响偶联过程。 使用这种方法偶联，抗体分子必须是糖基化的。多抗通常是糖基化的，反应过程中很好，其他抗体制剂应不含有多聚糖。此外，由杂交瘤细胞合成的单抗可能没有糖基化修饰，细菌合成的重组抗体同样也可能没有被糖基化修饰。因此，在试图通过多聚糖结构来进行抗体偶联时，特别是杂交瘤合成抗体和重组抗体，在偶联之前应检测免疫球蛋白是否含有多聚糖。 |
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13楼2019-05-07 19:57:21
14楼2019-06-03 12:07:49
★
lizimu566(金币+1): 谢谢参与
lizimu566(金币+1): 谢谢参与
驼类单克隆抗体是个新趋势，能发很好的文章，具体的抗体制备方法就是免疫羊驼、建库、筛选噬菌体等等。这里有篇介绍羊驼抗体制备的文章，可以看下 http://www.ktsm-life.com/news-detail-265.html |
15楼2019-08-27 16:41:39
16楼2019-11-09 16:02:48
18楼2020-07-09 23:13:18
简单回复
longwave2楼
2019-04-30 13:38
回复
lizimu566(金币+1): 谢谢参与
祝福 发自小木虫Android客户端
youngen3楼
2019-04-30 15:30
回复
2019-04-30 15:33
回复
lizimu566(金币+1): 谢谢参与
tzynew5楼
2019-04-30 18:15
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lizimu566(金币+1): 谢谢参与
nono20096楼
2019-04-30 20:32
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lizimu566(金币+1): 谢谢参与
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Biotage7楼
2019-05-02 20:34
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lizimu566(金币+1): 谢谢参与
2019-05-02 20:41
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lizimu566(金币+1): 谢谢参与
youngen9楼
2019-05-04 18:50
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youngen10楼
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syhorchid11楼
2019-05-04 22:31
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lizimu566(金币+1): 谢谢参与
miaojiabing12楼
2019-05-05 08:19
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卜卜元元17楼
2020-03-09 16:52
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lizimu566(金币+1): 谢谢参与
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