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【调剂】北京石油化工学院2024年16个专业接受调剂
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书画江湖

新虫 (小有名气)

[交流] siRNA转染实验注意事项已有1人参与

为了达到高的转染效率,在转染实验过程中,需要注意以下几点:

1.纯化siRNA

siRNA的浓度和纯度对转染实验非常重要。为得到高纯度的siRNA,推荐用玻璃纤维结合,洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸,小的寡核苷酸,蛋白和盐离子。注意:化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化(即PAGE胶纯化)。

2.避免RNA酶污染

微量的RNA酶将导致siRNA转染实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在,如皮肤,头发,所有徒手接触过的物品或暴露在空气中的物品等,因此保证实验中的每个环节不受RNA酶污染非常重要。

3.健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性

通常,健康的细胞转染效率较高。此外,较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。为了优化实验,推荐用50代以下的转染细胞,否则细胞转染效率会随时间明显下降。

4.选择合适的转染试剂

针对siRNA制备方法以及靶细胞类型的不同,选择好的转染试剂和优化的操作对siRNA实验的成功至关重要。如Entranster-R4000,专门针对siRNA等RNA转染。

5.通过合适的阳性对照优化转染和检测条件

对大多数细胞,看家基因是较好的阳性对照。将不同浓度的阳性对照的siRNA转入靶细胞(同样适合实验靶siRNA),转染48小时后统计对照蛋白或mRNA相对于未转染细胞的降低水平。过多的siRNA将导致细胞毒性以至死亡。

6.通过标记siRNA来优化实验

荧光标记的siRNA能用来分析siRNA稳定性和转染效率。标记的siRNA还可用作siRNA胞内定位及双标记实验(配合标记抗体)来追踪转染过程中导入了siRNA的细胞,将转染与靶蛋白表达的下调结合起来。
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吃瓜的半仙

新虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
这位虫友整理的关于siRNA转染的注意事项总结的还是很全面的,其中选择合适的转染试剂是很有必要的,除了提到的Entranster-R4000,QIAGEN,BIODAI等都是不错的选择,可以根据需要选择。
2楼2019-05-07 13:44:23
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