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burma9

新虫 (小有名气)

[交流] 敲除基因同源重组问题

本人最近在做酵母基因敲除和表达。都是采用同源重组的方法，敲除的方法是同源臂-启动子-抗性基因CDS-终止子-下游同源臂。但是同源臂和启动子、终止子序列都是从基因组上PCR扩增的，采用电转化的方法将DNA片段转入酵母中，会不会启动子和终止子区域就与酵母基因组上的同源序列发生重组了呢？包括在酵母中进行基因的表达，也是采用rDNA当同源臂，rDNA-启动子-表达基因-终止子-rDNA，理想状况下是rDNA序列发生同源重组，将rDNA-启动子-表达基因-终止子-rDNA重组到rDNA区域，但是会不会启动子和终止子也重组到基因组上，这样就降低阳性概率呢？
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1楼2019-03-15 10:14:14
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burma9

新虫 (小有名气)
顶一顶

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5楼2019-03-20 09:25:29
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梦与命

新虫 (小有名气)
★
burma9(金币+1): 谢谢参与
您好下游基因后必须加终止子吗

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6楼2020-08-02 08:35:08
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源井生物b

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
burma9(金币+1): 谢谢参与
渊博震天: 金币+10, 鼓励积极回帖 2021-02-11 08:55:02
是有这种可能的，已经构建好载体的话可以尝试一下，用抗性筛选看是否有重组上的菌株，如果有的话再在同源臂上设计引物做pcr鉴定；如果最终没有阳性菌株，可以把启动子和终止子序列更换一下
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8楼2021-02-10 11:27:36
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6698

新虫 (正式写手)
★
burma9(金币+1): 谢谢参与
引用回帖:
8楼: Originally posted by 源井生物b at 2021-02-10 11:27:36
是有这种可能的，已经构建好载体的话可以尝试一下，用抗性筛选看是否有重组上的菌株，如果有的话再在同源臂上设计引物做pcr鉴定；如果最终没有阳性菌株，可以把启动子和终止子序列更换一下

你好 我获得了疑似转化子，表型也发生了很大变化，但是pcr验证被敲除的基因还在，pcr验证抗生素新霉素条带很浅很浅。

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9楼2021-05-18 19:43:49
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cTiyAmo

新虫 (初入文坛)
★
burma9(金币+1): 谢谢参与
同学您好，请问您还在做这个课题吗

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10楼2022-03-02 09:51:01
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syhorchid2楼
2019-03-15 10:33   回复  
burma9(金币+1): 谢谢参与
miaojiabing3楼
2019-03-15 12:33   回复  
burma9(金币+1): 谢谢参与
youngen4楼
2019-03-15 21:53   回复  
burma9(金币+1): 谢谢参与
芋圆圆圆7楼
2020-08-02 09:25   回复  
burma9(金币+1): 谢谢参与
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