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remax520

木虫 (正式写手)


[交流] 【二代测序-口腔采样】细菌16s多样性—口腔样本采集方法汇总

近年来,口腔微生物多样性与口腔疾病甚至消化道疾病关系有着密不可分的关系,如何正确的了解请口腔微生物,就涉及到采样的标准化操作了。

以下为大家总结了,微生物多样性研究中,口腔样本采集操作方法,资料整理来源于:HMP。如下内容也同时整理成了文档,文末提供下载方式。

一、口腔样本采集所需材料

【二代测序-口腔采样】细菌16s多样性—口腔样本采集方法汇总



二、口腔各部位样本采集方法

        1. 样本采集总原则

        a.  采集所有样本应使用无菌技术(详见附录2);

        b.  每个样本收集后,将管子放在拉链塑料袋中,放置于冰上;

        c.  4小时内完成收集,送检或干冰运输。

        2. 样本采集顺序

        a)  唾液

        b)软组织位点 [1]

        c)硬组织位点

        [1] 软组织位点中的喉咙部位,由于条件反射而造成采样困难,因此最好在其他位点样本采集完成后,最后一个采集喉咙样本。
  
         3. 唾液样本采集

       方法一:要求受试者唾液在口腔中收集1min,要求受试者将唾液流入实现标记好的50mL收集管中(平顶螺帽锥形无菌聚丙烯管)。该过程可以重复数次,用于收集更大体积的唾液(2~5mL)。

       方法二:唾液可以通过标准大小的无味口香糖刺激产生(1~1.5g,箭牌有限公司)。口香糖放在受试者口中,要求受试者不要吞咽唾液,并有规律地咀嚼口香糖。充分积累口腔中的唾液,并将唾液流入标记好的收集管中。该过程可以重复数次,用于收集更大体积的唾液(2~5mL)。

        4. 软组织位点样本采集

        原则:

        a.  所有软组织位点的样本采集,均采用样本采集拭子完成。

        b.  拭子采集后立即在750μL MoBio缓冲液中充分旋转。

        c.  拭子海绵多次在管壁上挤压持续20s,确保微生物从拭子转移到缓冲液中。

        d.  在MoBio缓冲液中的样本需要保持低温运输或直接检测。 ?软组织位点采集的样本,分别做好标记,并标明主体位置来源。

        4.1 舌背样本采集

        擦拭舌背中心1平方厘米  5s。

        4.2 硬腭样本采集

        擦拭整个硬腭10s。

        4.3 颊粘膜样本采集

        a.  擦拭左右颊粘膜各10s。

        b.  注意不要接触到牙齿。

        4.4 角质化(附着)牙龈样本采集

        擦拭上颚前附着牙龈10s。
  

【二代测序-口腔采样】细菌16s多样性—口腔样本采集方法汇总-1


(口腔各部位示意图)



        4.5 腭扁桃体样本采集

        a.  擦拭左右腭扁桃体各5秒钟;

        b.  专注于缝隙和凹陷处。

        4.6 喉咙样本采集

        a.  受试者张开嘴巴,放松舌头;

        b.  将压舌片插入舌头后部,让整个舌头不受阻碍;

        c.  轻轻擦拭口咽处5秒钟。

        d.  注意:不要擦拭扁桃体。

        ?备注:由于条件反射喉咙处样本采集最为困难。建议该处作为最后一个样本采集点,排序在所有软组织和硬组织样本采集顺序之后。
        
        5. 硬组织位点样本采集

        目的:

        a.  从目标牙齿上采集到牙菌斑;

        b.  2颗臼齿,2颗前臼齿(槽牙),2颗门齿。

        5.1 龈上菌斑样本采集

        a) 臼齿

        1)2颗臼齿必须采样;

        2)第一颗采集右上侧臼齿,第二颗采集左下侧臼齿;

        3)如果同侧的第一颗臼齿近中面不平整带有损伤,就在该颗臼齿上采集样本;

        4)如果同侧第一颗臼齿近中面平整无损伤,就在临近的第二颗近中面不平整带有损伤的臼齿上采样,目的是尽可能多的从不平整带有损伤的牙齿上采集样本;

        5)如果同侧的臼齿都平整无损伤,则采集第一颗臼齿。

        b) 前臼齿(槽牙)

        1)2颗前臼齿必须采样;

        2)第一颗采集左上侧前臼齿,第二颗采集右下侧前臼齿;

        3)如果同侧的第一颗前臼齿近中面不平整带有损伤,就在该颗前臼齿上采集样本;

        4)如果同侧第一颗前臼齿近中面平整无损伤,就在临近的第二颗前近中面不平整带有损伤的前臼齿上采样,目的是尽可能多的从不平整带有损伤的牙齿上采集样本;

        5)如果同侧的前臼齿都平整无损伤,则采集第一颗前臼齿;

        6)如果前臼齿由于正常拔出而导致缺失,就从未缺失的前臼齿上采集样本,无论该前臼齿是否不平整、有损伤。

       c) 门齿

        目的:

        1)2颗门齿必须采样;

        2)第一颗采集左上侧中门齿,第二颗采集右下侧中门齿。

        采集步骤:

        1)对于第一颗牙齿,用棉球遮挡非采样部分,保留采样部分;

        2)用空气-水注射器的温和气流吹干;

        3)采用Gracey龈下刮治器从选定牙齿的近中面尽可能多的刮取牙菌斑;

        4)浸没刮治器尖端于MoBio管子内的MoBio Buffer中4~5s;

        5)擦掉刮治器尖端的牙菌斑于收集管内侧;

        6)该位点的采样可以立即重复一次采样过程;

        7)所有选定的牙齿均可以重复以上过程。

        注意事项:

        1.  如果受试者牙菌斑较少,则应同时对臼齿和前臼齿的牙弓进行采样。例如,一颗左上侧臼齿和一颗右下侧臼齿(近中端),和一颗右上侧前臼齿,和一颗左下侧前臼齿应该进行采样(共10颗)。

        2.  盖上收集管盖,摇晃4~5s,试图最大限度的分散样本。

        3.  在临床医学研究及病情记录中,记录采样牙齿及其采样情况。

        5.2 龈下菌斑样本采集

        1)对龈下菌斑样本采集,将棉球隔离出采样区域并干燥,去除残留的龈上菌斑;

        2)用Gracey龈下刮治器,在需要采样的牙齿近中颊侧采集龈下菌斑。

        3)将刮治器尖端浸没在MoBio管中的MoBio buffer中4~5s。

        4)在收集管内侧,刮掉刮治器尖端的收集物。

        5)根据临床诊断,去除大量血液的样本(例如:溢血发生)

        6)由于出血的风险,不推荐立即在同一位点重新采样。

        7)如果认为收集斑块是不够进行检测的(受试者口腔非常干净),按照之前描述的在待取样牙齿的临近牙齿上取样。

        8)若合并的斑块仍旧不够,然后在同侧第二课臼齿的中颊侧采集龈下菌斑,并与之前的收集物合并作为第一颗臼齿采集的样本。

        9)盖上收集管盖,摇晃4~5s,试图最大限度的分散样本。

        ?注意:

        龈上菌斑样本收集在一个MoBio管子中,龈下菌斑样本收集在另外一个管子中,每个管子标记好,采样位点并贴上标签。

三、附 录

        附录1 口腔检测套装

        建议至少有3个完整的工具包包含下列工具:

        ①带有刻度标记的Michigan-O 探针

        ②敷料钳

        ③Micro Mini Five Gracey 龈下刮治器 (刮治片小20% 更舒适且易于插入,并能减少组织肿胀)

        ④豪孚迪单端镰刀型探针 (#54)

        ⑤豪孚迪锥口镜# 5-双面

        以上器具使用后应清洗灭菌后置于暗盒中保存。

       附录2 无菌技术

       原则:

        1)所有样品的收集和处理采用无菌技术。

        2)每个SOP中所有收集的材料保证清洁和无菌或确认无菌后再购买和使用。

        3)以下是无菌技术的建议。

        4)无菌技术操作适用于所有样本采集SOP。

        附录2 无菌技术—准备样本采集管

        1)无菌用品包括(但不限于)管子、tips、MoBio buffer和SCF-1缓冲液

        2)如果管子要填充满,MoBio Buffer和SCF-1 将分装在层流罩。

        附录2 无菌技术—受试者样本采集

        1.按照当地安全委员会和/或机构政策的所有安全准则处理生物样本。手套、安全眼镜或面罩和实验外套必须在分装血清全程穿戴。在收集任何生物样本时,应注意预防措施,包括至少戴手套。

        2.当在采样过程中,手我样本收集管时,应注意保持手套干净,以免造成收集管内外交叉污染。

        3.样本采集过程中,使用干净的一次性手套。

                a)当采集皮肤和鼻腔样本时,在采集鼻腔样本前采集四个皮肤位点。只要拉伸皮肤时,不接触采样区域,采样员可以带着一副手套完成所以皮肤位点的样本采集。 一旦与采样区域发生接触,应更换完手套后进行下一点皮肤样本采集。

                b)研究人员可以在同一个受试者口腔使用一副手套完成不同口腔位点样本的采集。

        附录2 无菌技术—样本检测

        无菌用品包括(但不限于)管、tips、所有的缓冲器/试剂。


以上内容同样已经整理成文档,供大家下载:

链接:https://pan.baidu.com/s/13j3b2pdec4xWmNuGPht4Kg
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