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【调剂】北京石油化工学院2024年16个专业接受调剂
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吃瓜的半仙

新虫 (小有名气)

[交流] 实时定量PCR步骤

哪位大侠有实时定量PCR的详细操作步骤，我是初学者。谢谢
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1楼2019-02-21 15:46:13
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BioThriller

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
吃瓜的半仙: 金币+3, 谢谢 2019-02-22 08:41:09
以下是SYBR Green 的Protocol
1x
H2O                          6.3μl  
SYBR Reagent             5μl
Fwd 10uM         0.1 μl
Rev 10uM         0.1 μl

这四个试剂可以做一个Mix，分装
最后加cDNA
cDNA 1:5            1.0 μl    (注：cDNA 可以稀释为1：10，或者 1：5 ，可以先试验一下）
Total        12.5μl

qRT-PCR 程序  （我们用的是Roche LightCycler 480 II）

95°C 2 min,

40 cycles (95°C, 15 s; 60°C, 30 s; 68°C, 20 s).
最后Relative expression 用2-△△CT 法，

如果第一次做新引物，记得单独跑一下引物看看溶解曲线，希望对你有帮助。具体过程中应该还有很多需要注意的事情，也会出现各种问题，网上也有挺多的帖子，最好找个人带一下！
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2楼2019-02-21 23:03:26
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别踩我的菜

新虫 (小有名气)
以RNA为模板的定量PCR用BIOGHC Elitefast SYBR One Step Kit，逆转录和定量PCR在一个反应管内一步完成，中间无开管和移液动作，操作非常简便，优化的缓冲液，确保了RT和定量PCR反应能够快速、高效地完成。检测灵敏度可达到1pg总RNA。
赞一下 回复此楼
3楼2019-02-22 08:42:58
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