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[交流] 【干货】-Southern blot专场

哈喽,小伙伴们!走过不要错过,又到了科普知识的时间了,喜欢做分子实验的小伙伴一定听说过southern blot这门检测技术,但大家知道为什么叫southern吗?今天小编就为大家科普一下这门实验技术

southern blot是最早出现的blot(印迹)技术,它是检测dna的一种方法。这项技术之所以被命名为“southern”,主要是因为此技术在20世纪70年代由一位叫edwin southern的英国生物学家(见图1)发明,科学界为纪念该技术的诞生便以发明者的名字来命名,即southern blot[1]。

【干货】-Southern blot专场


图1. edwin southern[7]


(埃德温·迈勒·萨瑟恩)




southern blot


实验原理及步骤‍




了解了southern 的由来,接下来小编带大家一起学习southern blot实验原理及步骤。

southern blot基本原理:具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下,可按碱基互补的原则特异性地杂交形成双链。其操作过程是利用特定酶将dna消化成片段,再进行电泳分离,然后将胶上的dna变性并在原位将单链dna片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上,经干烤或者紫外线照射固定,再与相对应结构的dig标记探针进行杂交,用放射自显影或酶反应显色,从而检测特定dna片段分子的含量(见图2)[2]。

【干货】-Southern blot专场-1


图2. southern blot 操作过程[2]



southern blot


检测技术在模式动物制备中的应用‍



虽然距离这项技术发明已经过去很多年,但这项检测技术仍被广泛的应用在各种生物实验研究中。
如下图所示,为了鉴定携带条件性satb1等位基因的供体质粒通过同源重组方式整合到小鼠的satb1特异性位点上(见图3a),研究者们提取供体小鼠与wild小鼠肝脏基因组dna,经限制性内切酶eco rv (b) or spe i (c,d)酶切,同时选择用于southern印迹分析的dna探针。探针位于待靶向的基因中,但在靶向载体外部设计5’与3’外源探针(5’ external probe与3’external probe)以及内源egfp探针(gfp internal probe)。通过southern blot检测显示,5’与3’外源探针分别与酶切后对应基因组片段发生杂交,说明供体质粒在5’与3’端与靶基因组同源重组(见图3b,d),与预期插入位置一致;经内源egfp探针杂交显示为一条带,说明条件性satb1等位基因以单拷贝插入到靶基因座上(见图3c)。[3]

【干货】-Southern blot专场-2


图3. southern blot分析鉴定供体质粒靶向小鼠satb1 基因座及拷贝数[3]




那么既然说是同源重组“事件”,对于“事件”肯定有很多不确定性。如图4a所示,5’与3’同源臂均发生同源重组后,可将靶载体正确的插入到目的基因组中,获得研究所需的目的片段。当然,有的时候也会出现异常情况(见图4b),比如同源重组仅发生在5’末端,但3’末端没有发生同源重组,而是直接被插入至基因组中。在这种情况下,5’外源探针显示靶向等位基因片段符合预期,但3’端显示为野生型片段。此时,如果不通过设计同源臂外两侧dna探针策略来验证同源重组是否正确,这很大程度上会增加后续研究的风险性。[4]

【干货】-Southern blot专场-3


图4. southern blot鉴定同源重组事件[4]




另外,在制备基因敲进和条件性基因敲除模式小鼠过程中,southern blot检测是非常重要的一步。在我们以往的工作中,其中一例cre定点敲进课题(如图5),southern blot检测结果显示:小鼠1号,有明显的随机插入现象。

【干货】-Southern blot专场-4


【干货】-Southern blot专场-5


【干货】-Southern blot专场-6


图5. southern blot 检测定点敲进



southern blot检测技术虽不是万能的,但绝对是金标准!
也有人会说:既然是随机插入,很可能插入在不同染色体,理论上就完全可以通过后续交配稀释或去除,那再多交配一代是不是就可以稀释甚至去除随机插入呢?
让我们看看事实是怎样的:依据我们大量的数据统计分析发现,采用es细胞方式制备,大约有20%的概率有随机插入,由于es细胞法制备中可以在细胞这一步就进行southern鉴定,进入下一批小鼠制备的es细胞可以确保为southern阳性;而采用crispr/cas9技术,随机插入的概率约32%,不同的是用crispr/cas9就直接得到了小鼠,只能在小鼠水平筛除随机插入。而这32%中有14%的随机插入是无法靠交配传代去除的(见图6)。是否“随机插入”不是真的“随机”的呢?是不是像转基因一样,更多的情况是打靶载体或插入序列,会容易在目的插入位点插入多个拷贝,造成同一染色体/同一位点的多拷贝“随机”插入呢?[8] 我们没有详细做过调研,但是接近一半可分离的随机插入比例,预示了有这种可能。而此时,只能通过southern blot对基因组dna特定序列定位,进而排除随机插入的风险。[5-6]
   因此,southern blot虽然有它自己的限制,如费用高,片段有技术极限等,但仍然是模式动物制备检测随机插入的金标准!

【干货】-Southern blot专场-7


图6. 随机插入的概率分析[5]




百奥赛图自主开发的基于c57bl/6小鼠胚胎干细胞的基因编辑系统具有独特的品系优势,crispr/cas9技术自主研发的egeⓇ系统将同源重组率提高近20倍,并且一直坚持pcr/dna测序和southern blot鉴定双重质控。目前基因改造大小鼠及细胞系年制备能力>1500项,灵长类动物4种。欢迎小伙伴们前来咨询及合作!

参考文献
[1]https://en.wikipedia.org/wiki/southern_blot
[2]nelson, d.l, cox, m.m.lehningers principles of biochemistry, 5th edition. 2008
[3]sommer d, et al.efficient genome engineering by targeted homologous recombination in mouse embryos using transcription activator-like effector nucleases.nat commun.2014;5:3045.
[4]http://ko.cwru.edu/info/targvect design.html
[5]http://www.sohu.com/a/245580793_227596
[6]http://www.bbctg.com.cn/index/index/knowledge/id/52.html
[7]https://baike.baidu.com/item/southern blot
[8]ng p, et al. the molecular basis of multiple vector insertion by gene targeting in mammalian cells. genetics.1999 mar;151(3):1143-55.

【干货】-Southern blot专场-8

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LAB9

金虫 (著名写手)

一看就脑大专业性太强。

发自小木虫Android客户端
平平淡淡才是真
2楼2019-01-12 17:48:58
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