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【技术前沿】 F类腺相关病毒载体介导的高效基因编辑技术
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引言 近年来，基因编辑技术研究持续火热，在小鼠胚胎干细胞同源重组技术之后陆续出现了ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9 等基因编辑技术。大家都知道ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9 属于核酸酶介导的基因编辑技术，那么有非依赖于核酸酶的基因编辑技术吗？人类文明的发展在于伟大人类不断的探索研究，没错，答案是肯定的！ 前不久就有文章发表了一种非核酸酶介导的基因编辑技术：F类腺相关病毒载体介导的高效基因编辑技术。 下面由小编给大家讲述这篇文章中有趣的故事。 技能PK大赛--初筛 技能PK大赛开始啦！参赛选手见C图，从左到右依次是B类腺相关病毒载体AAV2，A类腺相关病毒载体AAV6，E类腺相关病毒载体AAV8，以及F类腺相关病毒载体，包括AAV9、AAVHSC1以及它的同胞们，其中AAVHSC系列来源于造血干细胞。 以上选手按照A图的方式构建了PPP1R12C-GFP (ssDNA)包装病毒载体，如果PPP1R12C-GFP (ssDNA)包装病毒载体发生了正确重组， 就会由PPP1R12C的内源启动子启动GFP的表达。为了公平起见，本次比赛选择的位点是AAVS1位点。在此感谢原代CD34+细胞系和甲肝细胞HepG2癌细胞系以及其他细胞（在此不一一致谢）的大力支持。 B图是部分选手电转CD34+细胞系和HepG2癌细胞系的比赛结果，可以看出载体浓度和GFP的表达水平是线性相关的，并且F类腺相关病毒载体基因编辑效率很明显优于A类。 C图是全部选手电转CD34+细胞系后GFP表达的比赛结果，F类腺相关病毒载体电转后的GFP表达水平远高于A、B和E类。 D图是电转CD34+细胞系后细胞核内载体基因组纯化测量结果，结果显示电转48小时后F类腺相关病毒载体入核效率比A、B和E类高超过27倍！理论上只有入核之后才可能会发生基因编辑，因此如何效率与基因编辑效率非常相关。 通过以上直观的结果来看F类腺相关病毒载体在这轮比赛中脱颖而出！那么接下来需要通过考官的质检验证一些问题：F类腺相关病毒载体介导的基因编辑效率真的很高效吗？很精准吗？会有其他插入或缺失的发生吗？会脱靶吗？带着以上问题我们继续看故事是如何发展的。 技能PK大赛--质检 技能PK大赛质检需要做以下几个项目的检测： 第一项：流式细胞术检测GFP的表达情况 ，如A图。结果显示F类腺相关病毒载体介导基因编辑效率达到了40%~60%的高水平！对照组均没有发生基因编辑。 第二项：靶向整合分析方法-Junction PCR检测分子水平的重组情况，如B图。在同源臂外侧野生型上设计引物F，在插入序列GFP上设计引物R，2个引物搭配扩增，若正确重组可以出~1.7kb条带，没有正确重组不出带。结果显示电转F类腺相关病毒载体的细胞可以扩增出正确重组的目的条带，并通过Sanger测序正确。对照阴性无条带。 第三项：微滴式数字PCR（即ddPCR）方法对电转后细胞系靶位点的等位基因进行定量分析，主要通过实验中对GFP和同源臂外的野生型序列信号的判读精准检测经过基因编辑的等位基因比例。C图是ddPCR 定量分析等位基因的结果与流式细胞术检测GFP表达的结果的相关性分析。分析结果显示GFP表达水平与发生基因编辑等位基因的比例是高度相关的。即通过流式检测GFP表达可以准确测量出基因编辑效率。D图专门对比了通过筛选GFP表达细胞对细胞进行流式分选之前和之后分别对应等位基因发生基因编辑的情况，结果显示分选之后基因编辑比例37%，而分类之前是11%，说明F类腺相关病毒介导的基因编辑是随着时间的推移稳定持续发生的。 第四项：二代测序（NGS）确定F类腺相关病毒介导的基因编辑是否有NHEJ的发生，如E图。结果显示除了自然发生的SNP之外，只有GFP序列有4个碱基发生突变，即F类腺相关病毒介导的基因编辑发生错误编辑类似indels的概率极低（ <4.21E−6 ），同时也没有发现非正确重组情况的发生。 综合以上检测结果表明， F类腺相关病毒载体介导的基因编辑高效而精准，那是否就可以颁奖了呢？此处好像有质疑的声音：是不是刚好凑巧F类腺相关病毒载体刚好在AAVS1位点表现出高效精准的基因编辑呢？其他位点的基因编辑效率怎么样？其他类型的基因编辑比如原位替换（突变）也可以做到很精准的编辑吗？带着这些问题，故事继续。 才艺表演一：人IL2RG位点验证F类腺相关病毒载体介导的基因编辑效率，如F图。设计分别打靶IL2RG的ATG后面和intro7，即分别对应不同的打靶载体，都可以通过基因编辑同源重组到靶位点而启动GFP的表达。这2个打靶载体电转CD34+细胞后流式检测结果表明在IL2RG位点也可以发生F类腺相关病毒载体介导的基因编辑。 才艺表演二：原位替换类型的基因编辑验证F类腺相关病毒载体介导基因编辑类型的广泛性，如A图和B图。A图是设计策略，2个碱基的突变会使靶位点的NheI酶切位点变成SphI。为了方便后续的PCR验证，在2个碱基突变的下游插入了12bp的linker序列。这个打靶载体分别电转了CD34+, K562, 和HepG2细胞系，通过PCR并送测序验证有原位替换的发生，如B图。结果表明F类腺相关病毒载体可用介导原位替换类型的基因编辑。 经过一轮才艺表演， F类腺相关病毒载体再次给我们展示了他们在基因编辑方面的高效率和高精准基因编辑能力。那么大家想知道他们是怎么做到的吗？跟着小编一起继续看下去吧！ 文章针对前面的疑问做了一个假设：介导DNA损伤应答和保持基因组完整性等的特定功能基因突变的话可能会影响基因编辑。接下来文章通过一系列实验验证了这个假设，具体如下： PPP1R12C-GFP (ssDNA)包装A、B、E和F类腺相关病毒载体分别电转12个病原性B LCLs和CD34+细胞系。12个病原性B LCLs分别有不同的DNA修复相关的功能基因发生突变。CD34+细胞系作为对照。如A图和B图。结果显示只有当BRCA2基因发生突变才会导致所有腺相关病毒载体丧失基因编辑能力。C图进一步验证了这个结果，即使用F类腺相关病毒载体分别电转成纤维细胞系EUFA423（BRCA2阴性）和BRCA2阳性细胞系，同时对照转基因载体电转这2个而细胞系的结果，如C图显示，BRCA2阳性细胞系中基因编辑效率和转基因差不多。但是BRCA2阴性细胞系中基因编辑效率大大下降，编辑效率很低。 以上数据进一步说明BRCA2基因在F类腺相关病毒介导的基因编辑过程中是必需的，但是文章在后面也提到了，具体如何发挥作用的目前正在研究中。 相信参加过大型学术交流会议的人都有感触，大多数人在面对汇报数据时，相比体外数据而言，更关心的是体内验证实验的数据。没错，我们的F类腺相关病毒载体要挑战体内基因编辑效率！请大家跟小编一起见证他们的成功！ 本研究构建了三个病毒载体： AAVHSC15空载体（含有luciferase不包括同源臂）、Rosa26-Luc包装AAVHSC15病毒载体以及Rosa26-Luc包装AAVHSC8病毒载体。 如A图，三个载体分别通过静脉注射进入Nonobese diabetic/SCID（NOD/SCID）小鼠模型，如B图，生物发光成像显示F类腺相关病毒载体在体内仍然可以介导基于同源重组的高效率基因编辑，并且没有组织限制，可以广泛编辑的。C图是利用线性介导的PCR（LAM-PCR）进行扩增并Sanger测序的结果，通过测序排除了病毒载体整合到基因组中的可能性。D图是通过southern blot进一步验证了F类腺相关病毒载体介导的高度精准的基因编辑能力。 southern blot实验用到的探针设计在luciferase序列上，正确重组allele可以通过SpeI酶切后经过southern blot得到~7kb目的条带，如D图第5泳道，未经过基因编辑的野生型allele没有条带，如第4泳道，前3个泳道作为内参对照，验证存在Rosa26-Luc质粒双链DNA的时候会通过DrdI和SpeI酶切后经过southern blot得到3049bp目的条带。假如存在Rosa26-Luc包装AAVHSC15病毒载体单链，2端的ITR很有可能会互补形成“snapback”结构而在电泳时跑的很快，若存在Rosa26-Luc包装AAVHSC15病毒载体双链，会通过SpeI酶切后经过southern blot得到2783bp目的条带。很明显，D图第5个孔都没有看到这2种情况。 综合以上数据可以看出， F类腺相关病毒载体在体内可以介导基于同源重组的高效率高度精准的基因编辑。 结语 文章通过层层深入的剖析，表明干细胞来源的F类腺相关病毒可以介导高效率、高精准度的基因编辑。 这项技术很明显有它的许多优点： 1，同源臂仅需要800bp左右，打靶载体构建较容易； 2，通过一系列PCR、测序和southern等验证表明基因编辑的发生仅依赖于同源重组，精准并高效。已有的数据表明没有随机插入和indels等情况的发生； 3，基因编辑可以发生在分裂和分裂后的细胞中，编辑具有广泛性。 不过文章也有提到： F类腺相关病毒介导基因编辑的深入分子机制正在研究中，除了BRCA2基因是否还需要其他因素的参与未知。基于目前的研究，F类腺相关病毒介导的基因编辑技术有望实现人类疾病的永久性治愈。 随着技能PK大赛的圆满结束，我们本期故事就要跟大家说再见了。由于时间关系，文章很多的细节没有一一说明，具体大家可以详细阅读文献进行了解。 最后再跟大家透露一个小秘密：文章中使用了一个动物模型Nonobese diabetic/SCID（NOD/SCID），大家知道我们百奥赛图有我们自己独特的动物模型吗？没错，就是具有百奥赛图知识产权的B-NDG小鼠，免疫缺陷程度更高哦，具体可以见公司官网。如果您还有其他感兴趣的动物模型，可以直接与我们联系哦！ 参考文献 Smith LJ, Wright J, Clark G, Ul-Hasan T, Jin X, Fong A, Chandra M, St Martin T, Rubin H, Knowlton D, Ellsworth JL, Fong Y, Wong KK Jr, Chatterjee S.Stem cell-derived clade F AAVs mediate high-efficiency homologous recombination-based genome editing.Proc Natl Acad Sci U S A. 2018 Jul 31;115(31):E7379-E7388. |
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