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请教各位

新虫 (小有名气)

[求助] pcr跑不出目的条带已有4人参与

之前梯度的时候跑出来了想要的条带,这几天在同样的温度下怎么都跑不出来,只有二聚体,请各位给看一下什么情况,体系是buffer2.5 dntp2.0 mg1.5 cdna1 f1 r1 extaq0.2 ddh2o补齐至25   pcr体系是94三分钟 94三十秒 ???三十秒 72一分半 35个循环 72七分钟 四度保存 重新设计的全长引物,之前二聚体都少,现在能看到二聚体,之前也看到过很多条带,现在条带跑不出来了,只能出来二聚体

@biostar2009 发自小木虫Android客户端
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渊博震天

版主 (职业作家)

Daryl

模板有问题?

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2楼2019-01-07 00:49:19
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请教各位

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 渊博震天 at 2019-01-07 00:49:19
模板有问题?

模板有问题不会有引物二聚体吧

发自小木虫Android客户端
3楼2019-01-07 08:21:57
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Cherishqj

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2019-01-12 09:51:44
引物二聚体是引物互补配对形成的吧,这不能说明模板没问题呢
4楼2019-01-11 11:44:09
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annwt

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

重新设计的全长引物--------那以前的梯度白做了
5楼2019-01-26 08:59:26
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xiaoyuan612

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

扩增有二聚体有可能是扩增条件有问题,看下模板的具体浓度,如果浓度低,就加大模板量,如果浓度过高,需要进行稀释,另外退火温度有没有摸过,如果跑出来很多条带,那么有可能是退火温度低了,另外还可以考虑换个酶试试
6楼2019-02-18 11:05:24
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cloveseven

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

1 新换的引物问题
2 这次PCR和上几次的模板是否一致
从这两个方面分析一下,ex-taq酶还是较好能PCR出来的
7楼2019-03-21 17:02:34
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正清哲和

至尊木虫 (著名写手)

★ ★ ★ ★ ★
渊博震天: 金币+5, 鼓励回帖交流 2019-04-10 08:27:20
一般来说跑梯度用mix跑的,模板用菌液、质粒、基因组DNA都可以,浓度要求不高,但确定温度后就用Extaq、pfu,尤其是pfu对模板的浓度要求很高,浓度高于20ng/ul就扩不出来了。不知你是不是遇到这种情况

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对他人,可以善待、珍重,但无需寄以厚望,依旧充满感激 ,做好自己!
8楼2019-04-09 22:41:11
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