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人溶菌酶的药理作用及在毕赤酵母表达系统中的表达研究已有1人参与
人溶菌酶是一种重要的非特异性体液免疫因子,对于人体而言是不可或缺的,药理研究表明其具有抗菌消炎、抗病毒和增强免疫力等功能。人溶菌酶在人体内分布虽然广,然而难以获取,因此人溶菌酶的广泛应用只能寄希望于采用DNA重组技术,利用酵母表达或真核表达系统进行大规模生产人溶菌酶。
人溶菌酶是人体本来就存在的一种蛋白质,作为药物使用不会对人体产生任何不良反应和副作用,即使长期使用也不会产生耐药性,一些生物公司提供的蛋白表达服务可以高效表达人溶菌酶。毕赤酵母表达系统是一种能够高效表达重组蛋白的系统,一方面由于毕赤酵母属于真核生物,因此毕赤酵母表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰,另一方面毕赤酵母生长速度快,可以将表达的蛋白分泌到培养基中,方便蛋白纯化。随着人溶菌酶研究的深入,相信终有一天会开发出具有重要临床价值的药物。
1、人溶菌酶的药理作用
(1)抗菌消炎
众所周知,肽聚糖是革兰氏阳性菌细胞壁的一种重要成分。人溶菌酶可水解肽聚糖中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺中的B-1,4糖苷键,在渗透压作用下导致革兰氏阳性菌细胞壁破裂,发生溶菌作用。在体内环境下,由于有分泌型免疫球蛋白A、补体参与,人溶菌酶还能水解某些革兰氏阴性菌,如大肠杆菌等。由于真菌细胞壁中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰葡萄糖胺之间形成的B-1,4糖苷键(几丁质)也是人溶菌酶作用的底物,所以人溶菌酶可以抗含有几丁质细胞壁的真菌感染。人溶菌酶还能与各种诱发炎症的酸性物质结合,使其失活,并增强抗生素和其他药物的疗效,改善组织基质的粘多糖代谢,从而有利于修复被炎症损伤的组织。
(2)抗病毒
人溶菌酶是一种碱性蛋白质,在体内近于中性的pH环境下带有大量正电荷,可与带负电荷的病毒蛋白起作用,和DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐,使侵入体内的病毒失活。
(3)增强免疫力
溶菌酶参与机体内多种免疫反应,在机体正常防御和非特异性免疫中具有重要作用。它可改善和增强巨噬细胞吞噬消化功能,降低细胞抑制剂导致的白细胞减少,结合细菌脂多糖,减轻内毒素作用,以达到增强机体抵抗力的目的。
(4)激活血小板
人溶菌酶能激活血小板,改善组织局部循环障碍,分解脓液,增强局部防卫,从而更好地体现抗菌、消炎、止疼等作用。
2、人溶菌酶在毕赤酵母表达系统的表达研究
(1)将α信号肽和人溶菌酶(hLYZ)基因作为整体进行密码子优化,并将其插入pPICZαA空载体,构建重组表达载体pPICZ-OptαF+hLYZ。通过转化筛选,获得一株稳定性较好的重
在5 L发酵罐中培养K1,细胞密度达到50 g-DCW•L-1开始诱导,甲醇浓度控制于5 g•L-1,最终的总蛋白浓度为1.71 g•L-1,总酶活达到262,152 U•mL-1。
(2)对α信号肽做了进一步的优化处理,新插入39个碱基,构成包含增长的信号肽和人溶菌酶(hLYZ)基因的新序列将其插入pPICZαA空载体,构建得到另一表达载体pPICZ-EhnαF+hLYZ,通过转化筛选获得重组子K4。K4摇瓶表达发酵液总蛋白浓度为320 mg•L-1,总酶活为16,974 U•mL-1,均优于K1。在5 L发酵罐中采用与K1相同的诱导策略,最终发酵液中的总蛋白浓度可达到2.54 g•L-1,比K1提高48.5%,但总酶活为258,712 U•mL-1,比 K1 略低。
(3)考察了 K4在高细胞密度(~100 g-DCW•L-1)下起始诱导的hLYZ表达性能。进行纯甲醇诱导,并将甲醇浓度控制于5 g•L-1,诱导54 h发酵液中的总蛋白浓度为3.02 g•L-1,但随后发生严重降解,诱导68 h后仅剩2.07 g•L-1。采用甲醇/山梨醇共混流加策略,优先将甲醇浓度控制于5 g•L-1,不控制溶解氧浓度,诱导68 h总蛋白浓度可达到2.88 g•L-1,未出现明显的蛋白降解现象。上述二种诱导策略下最高的总酶活水平分别为324,072 U•mL-1 和 290,438 U•mL-1。
(4)利用Bgl Ⅱ和BamH Ⅰ属于同尾酶的特点,设计多拷贝串联hLYZ基因表达载体,并获得了两拷贝及四拷贝串联hLYZ基因转化重组子K-2-2、K-4-2。摇瓶发酵条件下,K-2-2和K-4-2的最高总蛋白浓度分别为193.0mg•L-1和185.3 mg•L-1,对应的总酶活分别为5,256 U•mL-1和5,424 U•mL-1。5 L发酵罐中,K-2-2低细胞密度(~50 g-DCW•L-1)诱导73 h及高细胞密度(~100 g-DCW•L-1)诱导65 h后,发酵液中的总蛋白浓度分别为0.79 g•L-1和0.93 g•L-1,总酶活分别为70,332 U•mL-1和71,529 U•mL-1,约为重组子K1的50%。K-4-2诱导表达10 h后细胞失去活性,发酵失败。多拷贝串联hLYZ基因转化重组子的溶菌酶表达性能较低。
目前重组人溶菌酶的大规模生产还存在这样或那样的问题,但重组DNA技术发展日新月异,相信在不久的将来,会有高效表达的工程菌或工程细胞问世。美迪西生物医药在重组蛋白表达与纯化服务方面经验丰富,其拥有多种蛋白表达系统,包括原核蛋白表达系统、酵母蛋白表达系统、昆虫细胞蛋白表达系统(杆状病毒)哺乳动物细胞蛋白表达系统,具备多种融合技术,可以为客户在蛋白表达与纯化方面提供多种选择。从方案设计、基因优化、表达条件优化到纯化的技术体系,以提高客户的目的蛋白表达水平。 |
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