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soarshining

捐助贵宾 (著名写手)

[求助] 点突变实验为何相同条件P不出条带已有1人参与

最近在做点突变，之前用的试剂盒直接对质粒进行突变pcr，然后环化。可最近遇到个问题，相同的质粒、引物和反应体系，不知为何突然就怎么都扩不出条带来了，非常郁闷。对反应温度从55℃-tm都试了，仍然如此，不知道为什么。

[ Last edited by 渊博震天 on 2018-12-17 at 16:55 ]
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1楼2018-12-17 16:21:07
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soarshining

捐助贵宾 (著名写手)
点突变实验为何相同条件P不出条带点突变实验为何相同条件P不出条带-1

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2楼2018-12-17 16:30:34
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soarshining

捐助贵宾 (著名写手)
这是前后两次的图片，不知道为啥电脑传图总是security error。

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3楼2018-12-17 16:31:24
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zw破风

金虫 (正式写手)
建议换个模板试试

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4楼2018-12-17 17:26:39
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soarshining

捐助贵宾 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zw破风 at 2018-12-17 17:26:39
建议换个模板试试

额，意思是重新抽质粒吗？
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5楼2018-12-18 09:53:13
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GRUBBY_WU

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
soarshining(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2018-12-19 10:18:18
soarshining: 金币+10 2019-04-24 15:04:03
引用回帖:
5楼: Originally posted by soarshining at 2018-12-18 09:53:13
额，意思是重新抽质粒吗？...

之前也经常做点突变，偶尔会出现相同体系做不出来的情况。既然之前能P出来那引物设计肯定没毛病，重新稀释一个质粒模板和引物试试，温度就用之前的就好了。
我一般用phusion，8K质粒浓度5ng/ul，引物设计的差不多做梯度基本都能搞定。
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2019更好更棒!
6楼2018-12-18 10:16:22
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GRUBBY_WU

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by GRUBBY_WU at 2018-12-18 10:16:22
之前也经常做点突变，偶尔会出现相同体系做不出来的情况。既然之前能P出来那引物设计肯定没毛病，重新稀释一个质粒模板和引物试试，温度就用之前的就好了。
我一般用phusion，8K质粒浓度5ng/ul，引物设计的差不多 ...

图
点突变实验为何相同条件P不出条带-2



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2019更好更棒!
7楼2018-12-18 10:28:51
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soarshining

捐助贵宾 (著名写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by GRUBBY_WU at 2018-12-18 10:28:51
图

...

好漂亮~梯度是温度梯度吗？
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8楼2018-12-18 10:50:47
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GRUBBY_WU

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★
soarshining(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2018-12-19 10:18:37
引用回帖:
8楼: Originally posted by soarshining at 2018-12-18 10:50:47
好漂亮~梯度是温度梯度吗？...

这些是同一个位置上的不同突变，r引物相同，f引物中间不太一样，两端相同。取的其中一对引物在平均tm值上下先做梯度，选合适的温度一批扩的几种突变。体系固定，模板量固定，引物和温度合适一般问题不大。

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2019更好更棒!
9楼2018-12-18 11:39:36
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zw破风

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by soarshining at 2018-12-18 09:53:13
额，意思是重新抽质粒吗？...

可以重新抽提

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10楼2018-12-18 16:52:21
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