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【调剂】北京石油化工学院2024年16个专业接受调剂
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[交流] 疏水层析影响因素解析已有2人参与

疏水层析填料的选择
*不同的配基的疏水填料与蛋白的结合能力强弱不同,在进行疏水层析时要对不同的疏水填料进行筛选对比。

*同一配基的疏水填料由于配基密度不同,其和蛋白的的疏水作用力也不同,筛选填料时也要对不同的配机密度的疏水填料进行对比筛选。
样品的性质
蛋白质的疏水性强弱取决于其表面疏基团的分布,同时与样品缓冲液的离子强度,离子种类,pH,所处的温度都有一定的关系,在进行疏水层析时要保持恒定的温度,且要对样品缓冲液的离子种类及离子强度,pH进行筛选对比分析。详细请看连接https://mp.weixin.qq.com/s?__biz ... p;amp;lang=zh_CN#rd

层析柱反压升高或柱效下降

确保压力的升高是由层析柱引起的
检查在线滤器;从组分收样器开始断开管线,观察压力变化排除其他原因造成的压力升高。

层析柱使用过程杂质的积累
对填料进行清洗:先用0.5M的氢氧化钠洗1CV,然后用去离子水把碱洗掉(5CV),之后在用30%的异丙醇洗1CV,异丙醇洗完后用去离子水洗5CV,上样1CV 1mg/ml胃蛋白酶溶液(溶于0.1M乙酸,0.5M氯化钠,降解沉淀在层析柱上的蛋白),室温过夜,再用1.5CV 0.2M NaOH清洗,再用4CV去离子水清洗。

柱床太高
疏水层析装填高度建议在10-20cm,大于20cm反压增大。

流速过快
使用适当的流速。

层析填料被污染或老化
随着填料的使用,一些杂质的积累会使层析填料的孔径发生变化(如堵塞,非特异性吸附积累,微生物污染,破碎等),导致其排阻能力发生偏差而影响分离度。此时可对填料进行CIP清洗,若清洗后还不能达到分离要求,就要更换新的填料。
层析柱进气泡
大量进行很好脱气的去离子水反相冲洗平衡层析柱(30cm/h),气泡会被逐渐带出层析柱。
洗脱时没有收到目标物质或者洗脱量太少

目标物没有与介质结合或结合量较少
先确认目标物质是否和填料结合

洗脱时间不够
降低流速,延长洗脱液的保留时间

目标物质和填料结合强度太高
降低平衡液中盐浓度或更换盐的种类 或或更换结合能力较弱的疏水介质在 洗脱液中加入添加剂(少量去污剂或 者低浓度有机试剂)

层析缓冲液及温度
确保疏水层析时的温度适宜,且选择合适的缓冲液。
疏水层析时目标物不与填料结合或结合量较低
*确保合适的保留时间(上样速度)。
*目标物质和填料疏水作用力太弱,更换疏水性强的填料。
*缓冲液的离子强度太低,提高缓冲液的离子强度。
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weitaiyan

铜虫 (著名写手)


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PTFE多孔材料的蛋白质层析板可以过滤混合后沉淀的蛋白质,并且避免堵塞,破碎或乙腈等有机溶剂泄漏,这种过滤介质可替代耗时的离心和转移步骤。
www.spider-amoy.com
2楼2019-03-09 08:24:32
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克隆超人

铜虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
柱效对疏水层析影响大不大?我理解这种层析属于吸附层析,取决于洗脱剂的盐浓度和pH值,所以对于阶状洗脱来说,柱效的影响如何估测,影响的大不大?各位大神帮忙给分析一下!
3楼2023-01-04 13:26:52
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