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Kallistatin的生物学作用及在CHO细胞中的表达研究
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人组织激肽释放酶结合蛋白（Kallistain，KAL）是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，具有抗炎、抗氧化、抗血管生成及抗肿瘤等多种生物学作用。通过酵母表达系统进行Kallistain的重组蛋白表达纯化研究，发现毕赤酵母表达的Kallistain蛋白糖基化水平不足，与天然的蛋白质有一定的差异而无法采用。因此有研究者通过构建CHO-K1细胞高表达载体，并筛选高表达KAL蛋白的稳定株，悬浮无血清驯化后，批量表达纯化得到KAL蛋白并探索其对肝癌的作用。 现代生物学发展的主要方向之一为以蛋白质的结构和功能为基础，从分子水平上认识生命现象。蛋白表达纯化技术获得大量蛋白质的主要手段，美迪西生物医药提供重组蛋白表达服务，其拥有多种蛋白表达协同，包括原核蛋白表达系统、酵母蛋白表达系统、昆虫细胞蛋白表达系统（杆状病毒）哺乳动物细胞蛋白表达系统，具备多种融合技术，可以为客户在蛋白表达与纯化方面提供多种选择。从方案设计、基因优化、表达条件优化到纯化的技术体系，以提高客户的目的蛋白表达水平。 1、KAL的生物学作用 （1）抗炎 研究发现KAL在急性胰腺炎、炎症性肠病、类风湿关节炎、脓毒症患者血清KAL浓度下降，提供KAL可能在炎症反应中起到保护作用。进一步研究发现，KAL能够抑制炎症因子的表达，减轻炎症反应。 （2）抗氧化应激作用 氧化应激是高血压、动脉粥样硬化、缺血再灌注、糖尿病等疾病共同的病理生理机制，可导致内皮损伤、细胞凋亡、细胞间质纤维化。研究证明KAL可通过参与多条细胞通路的调控增加内皮型一氧化氮酶（eNOS）的活性，产生NO，发挥抗氧化应激作用。 （3）抗血管生成、抗肿瘤作用 血管生成是一系列的细胞事件包括内皮细胞的增殖、迁移，是肿瘤、糖尿病视网膜病变、关节炎等疾病的重要病理生理机制，对血管生产的干预，可望成为治疗这些疾病的靶点。目前多认为KAL的抗肿瘤作用是通过抗肿瘤血管生成，调控内皮细胞的分泌因子VEGF、bEGF介导的血管生产细胞通路发挥作用。 KAL的抗肿瘤作用已经被证实，起作用不仅仅是抑制血管生成，还能抑制癌细胞的增殖、迁移及侵袭。研究表明KAL具有诱导体外培养的结直肠癌细胞的SW480和HT-29凋亡的作用。KAL处理的SW480和HT-29细胞caspase3、caspase8水平明显增加，而caspase9水平无明显变化，这说明外源性凋亡途径参与KAL诱导的凋亡。 2、KAL在CHO细胞中的蛋白表达纯化研究 有研究者运用基因工程技术构建了含有Kozak序列，人白蛋白信号肽与人工设计的信号肽，穿膜肽TAT与pcDNA3.1、pTT5、pMH3、pMH3EN载体相连的18种载体。用PEI瞬时转染，双抗夹心ELISA检测，选取Kallistatin表达量最高的载体，运用优化的转染条件转染CHO-K1细胞，转染后36 h，消化转移至培养皿中，用筛选浓度G418来筛选，挑取单菌落接种到96孔细胞培养板中，G418继续筛选。 7天后ELISA检测细胞上清Kallistatin含量，选取阳性值高(A≥1.0)，有限稀释法克隆化。经三次克隆化后，逐渐扩大培养置100 mm细胞培养皿中，成功筛得表达Kallistatin的稳定株。然后悬浮无血清驯化后，批量表达优化，Ni柱纯化得到Kallistatin蛋白，并用SDS-PAGE和Western blot鉴定之。最后用CCK-8和Hoechst 33342染色以及Transwell实验分别检测Kallistatin对肝癌细胞的作用，并用Western blot初步验证Kallistatin对肝癌的可能原因。研究表明: (1)不同信号肽，穿膜肽对蛋白的分泌表达效果不尽相同。其中在研究中研究者使用的一种人工设计的信号肽对Kallistatin的表达量在不同载体都有显著提高。该研究构建的最佳载体是未优化载体的Kallistatin表达量的10倍。 (2)运用G418筛选，三次克隆化后成功筛选出表达Kallistatin的CHO-K1的4株稳定株——2F8、4B4、4E7和7D11。悬浮无血清驯化后，继续加维持剂量的G418和采用分次流加培养的方法，10天时培养基中Kallistatin蛋白浓度最高为11mg/L。批量表达Ni柱纯化CHO细胞表达的Kallistatin重组蛋白分子量为60 kD左右，比大肠杆菌(40 kD)和酵母(58 kD)表达的要略大。主要因为CHO细胞翻译后修饰以及有His标签。 (3)研究发现Kallistatin能抑制肝癌细胞的生长增殖，Tranwell实验表明Kallistatin可抑制其迁移和侵袭。Hoechst33343染色发现其可诱导肝癌细胞凋亡,其诱导肝癌凋亡的具体机制有待进一步研究。 随着对KAL生物学作用及蛋白表达纯化的研究，KAL可望以蛋白药物的形式出现为肿瘤、脓毒症等严重疾病提供新的治疗方法。 |
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