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重组人表皮生长因子的表达纯化及其生物活性监测研究
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重组人表皮生长因子（rhEGF）是由高效表达人表皮生长因子的大肠杆菌经发酵、分离和高效纯化后冻干制成的。进行重组人表皮生长因子的生物活性监测，可以为该药品临床应用价值的药物效价测定提供依据。生物活性监测是生物测定的重要内容，常采用的方法有MTS显色法、CCK-8显色法、结晶紫显色法、Cell Titer-Glo显色法等检测方法。 生物活性测定法是以药物的生物效应为基础，以生物统计为工具，运用特定的实验设计，测定药物有效性的一种方法，从而达到控制药品质量的作用，其测定方法包括生物效价测定法和生物活性限值测定法。上海美迪西的生物部在体外生物学领域有丰富广泛的经验，通过酶水平测定、细胞水平测定、细胞生物学、生物化学、体外同位素测定、稳定细胞株建立、基因敲除、RNAi和MicroRNA技术等，提供一套完整的生物学服务。 rhEGF与内源性的表皮细胞生长因子在结构、活性方面具有高度的一致性，其主要成分为重组表皮生长因子，具有趋化、增殖和重建等多方面药理作用。临床应用于治疗慢性溃疡如烧伤创面、糖尿病性坏疽、宫颈糜烂、角膜炎外伤性角膜缺损、皮肤磨削术、鼻中隔黏膜糜烂、鼓膜穿孔、肠道出血及肛裂、痔术等治疗。进行重组人表皮生长因子在毕赤酵母表达系统中的表达与纯化研究，为其未来的进一步应用打下了基础。 1、重组人表皮生长因子的蛋白表达纯化 在毕赤酵母X33中表达人表皮生长因子并纯化，对表皮生长因子(EGF)进行密码子优化，构建pPICZa A-EGF真核表达质粒，转化X33感受态细胞；利用抗性筛选以及PCR鉴定阳性菌株。经过甲醇诱导和镍柱纯化，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白分泌表达情况。成功构建了表达pPICZa A-EGF真核表达质粒，转入X33中获得阳性菌株，成功诱导蛋白分泌表达并纯化。在毕赤酵母X33中成功表达人表皮生长因子，纯化后纯度为80%，收率为5.8 mg/L。 2、重组人表皮因子的生物活性监测 建立重组人表皮生长因子(recombinant human epidermal growth factor,rh EGF)生物学活性的检测方法，并与其他4种常见显色方法进行比较。方法参考《中国药典》三部(2015版)附录3528中3T3细胞/MTT显色法，建立rh EGF生物学活性的检测方法，去除细胞饥饿的步骤，并用10%SDS代替DMSO，同时对培养3T3细胞的PRIM1640培养液的胎牛血清浓度(0、2%、5%、10%)进行优化。采用优化方法及药典方法同时检测rh EGF标准品，对灵敏度、信噪比、线性及孔间变异度进行比较。 分别采用优化方法、MTS显色法、CCK-8显色法、结晶紫显色法、Cell Titer-Glo显色法检测同批rh EGF供试品，比较各方法的检测结果。结果优化方法的灵敏度(半数有效浓度为2.84 IU/m L)、信噪比(1.40)、线性(R2>0.99)和孔间变异度(95%可信区间为1.576%~3.334%)均优于药典方法，且实验周期由6d缩短为5d。5种显色方法对rh EGF供试品的检测结果差异无统计学意义(P>0.05)，CCK-8显色法检测结果的变异系数(CV)最小(16.8%)，结晶紫显色法的CV值最大(23.3%)。因此优化方法更适用于rh EGF制品的常规生物学活性检测，且与其他4种显色方法等效。 人体中hEGF含量极微，提取和纯化较为困难，其产量和稳定性问题是制约我国表皮生长因子应用的瓶颈。利用酵母表达系统可获得有生物活性的重组人表皮生长因子，为rhEGF的进一步应用研究提供了基础。 |
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