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Nature Reviews Endocrinology| 洞见--肥胖和糖尿病动物模型
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据统计全球有超过三分之一的人口超重或肥胖，且进一步发展为‖型糖尿病的风险居高不下，迫切需要更加安全有效的治疗方法。在此临床大背景下，精选合理的动物模型以进一步发现、验证和优化新治疗方法并保证其临床安全有效极为重要，同时也加速了从实验室研究到临床应用的步伐。当使用动物模型进行肥胖和糖尿病研究时，存在很多干扰因素，如下图描绘了多因素相互关联的遗传和环境矩阵，可见完美的实验设计是不存在的。重要的是要意识到这些挑战，并以最理想的方式控制影响因素，以保证已发表结果的可解释性和可重复性。《Nature Reviews Endocrinology》刊登了慕尼黑理工大学Matthias H. Tschöp研究团队关于各类肥胖、糖尿病动物模型的综述文章。本文针对文章中大鼠、小鼠模型进行整理总结，关于非哺乳动物（秀丽隐杆线虫/果蝇/斑马鱼）、大型动物（如猪/比格犬）、非人灵长类动物相关模型总结可留言获取原文自行深度挖掘。 一、饮食诱导的动物模型 饮食诱导的动物肥胖模型与人类肥胖相似，常用来研究饮食、基因等因素与肥胖/糖尿病等疾病进程之间的关系。现整合肥胖和糖尿病研究框架下大鼠和小鼠模型相关影响因素（如动物品系、饮食、表型等）。 品系：1）近亲小鼠品系的遗传差异影响其对饮食诱导的肥胖和糖尿病的易感性。比如近交系C57BL/6J常用于饮食诱导肥胖（diet-induced obesity，DIO）模型，因为它易于发展为严重肥胖、脂肪积累、葡萄糖耐受不良和中度胰岛素抵抗。而其他近交系如SWR/J和 A/J小鼠对于DIO及相关并发症敏感性低，使其成为研究人类肥胖抵抗的理想模型。2）胰岛素抵抗方面，100多种近交小鼠品系在经过高脂高蔗糖饮食饲养8周后，不同品系间胰岛素抵抗（HOMA）差异极大，雌雄之间变化倍数更高达63倍或37倍不等。因此，必须仔细优化选择适合各具体研究的动物品系。比如，对于某药物抗糖尿病药效研究，DIO C57BL/6J小鼠模型并不是理想的选择，因为该品系很少发展成高血糖症和/或胰岛萎缩，而C57BL/6N品系小鼠经过3周高脂饮食即可出现肝脂肪变性、高血糖症和高胰岛素血症。3）饮食诱导肥胖的大鼠品系之间也存在差异，常用大鼠为远交品系，如Sprague Dawley、Wistar、LongEvans，这意味着个体间存在相当大的遗传变异，因此研究者要注意实验样本数。4）转基因小鼠中，129/Sv 和FVB小鼠是常用的基因敲除模型优选品系，而C57BL/6J更适合代谢性研究。此外，研究者还应采用单核苷酸多态性（SNP）分析来确认品系遗传背景，因为微小的遗传差异就能对实验结果产生影响，因此同窝出生动物是代谢性研究的最好选择。 性别：雄性小鼠更容易发生DIO，并且比雌性小鼠进展更快且程度更大，而相反在雌雄大鼠之间进行DIO进程研究更具可比性。1）饮食诱导的胰岛素抵抗和葡萄糖耐受不良的表型在小/大鼠性别之间差异更为显著，且雄性大鼠和小鼠受影响最大。比如肥胖程度相近，4个月雄性Zucker Diabetic Fatty (ZDF)大鼠会出现严重的高血糖症（~400 mg/dl）和低胰岛素血症（~1,000 pmol/l），而雌性ZDF大鼠则终其一生保持正常的血糖水平（~100 mg/dl）和胰岛素水平（~5,000 pmol/l），临床中糖血症中也存在性别二态性，虽然肥胖在女性中更为普遍，但全球T2DM患病率女性低于男性。2）肥胖并发症中的性别二态性与性激素（睾酮与雌二醇、孕酮的比例）及其对脂肪分布的不同影响有关。中心型肥胖尤其是内脏脂肪对健康有害，而下半身脂肪以皮下脂肪的形式增加实际上可能具有保护作用。雌性啮齿动物比雄性有更多的皮下脂肪和更少的内脏脂肪。雌性大鼠和小鼠卵巢切除能消除内源性雌二醇和孕酮的产生，导致脂肪分布男性化，并增加饮食诱导的胰岛素抵抗易感性。3）有证据表明非性腺性染色体特异性因子也在代谢差异表现中起作用。肥胖研究中的性别差异是常态而不是特例。全基因组关联研究（GWAS）数据支撑这个观点，强调性别特异性的遗传蓝图，表明肥胖和糖尿病的易感性差异。因此，研究人员应注意到近期NIH倡议对临床前生物医学研究中要进行性别调查研究。4）目前，临床前研究普遍使用雄性啮齿动物，尤其是在药物研究中。雌性啮齿动物被刻意避免，因为普遍而未经证实的假设认为雌性发情会引起无法预料的实验因素变化，因此，控制发情周期对研究很重要。此外，雄性因具有更明显的疾病表型而受到研究者青睐。显然，旨在预防或逆转肥胖和/或治疗T2DM的干预措施应该在两性中进行研究，以提高其转化价值。 年龄：年龄是影响肥胖和T2DM研究的另一个重要因素。临床上，体重、有无脂肪块、脂肪块重新分布都会随着年龄增长而增加（55岁达峰值）。肌内脂肪和肝内脂肪在老年人群增加尤其明显，其与胰岛素抵抗有关。1）与人类类似，老龄化同样影响啮齿动物的代谢，常用于代谢研究的C57BL/6J小鼠体重随着年龄增长而增加，在9个月时达到高峰，老年C57BL/6J小鼠（22月龄）与3月龄小鼠相比肌肉体重减少而脂肪重增加。大鼠和小鼠空腹血糖水平在一生中基本平稳，但葡萄糖耐受量在大鼠中通常随着年龄的增长而恶化，小鼠受到的影响较小。2）另一个重要因素是饮食干预开始时鼠的年龄。若小鼠年龄较小（<8周，经验值）时开始喂养HFD，则随后的肥胖和肥胖症表型并不会特别明显。 饮食：1）轻微的饮食差异就可以极大地影响代谢参数和实验结果。例如，大鼠膳食中动物源脂肪（如猪油）对肥胖和胰岛素抵抗的影响比植物脂肪更为显著。即使细微差异，如不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比例以及饮食形态（液体与固体）的改变，都会导致不同的DIO结果。例如，用于制备HFDs的脂肪源是决定无菌小鼠是否对DIO抗性或易感性的关键因素。2）必须考虑食物颗粒的质地和硬度，研究表明以粉状低脂饮食喂养的小鼠会自发产生多余脂肪。部分DIO响应可能取决于食物质地的改变而不是营养组成改变，因为HFD中使用的颗粒通常比相应对照饮食中使用的颗粒更软。3）保证营养成分在每个生产批次中可重复性。如果研究目标是评估特定饮食成分的影响，研究人员还必须注意选择适当的对照饮食。例如基于谷物的食物饮食与纯实验性HFD相比，这些食物成分可能因批次、季节和供应商而存在差异。非营养饮食成分的可变性如可溶性纤维含量和植物源性雌激素的变化也会影响DIO和代谢性疾病的进展，甚至影响行为特征。4）人类每天从脂肪中摄取30%热量，低于许多临床前DIO研究中啮齿动物摄入量（40%至60%卡路里来自脂肪）。特殊HFD（近80%的卡路里来自脂肪）研究结果的转化价值值得怀疑。代谢性内毒素血症假说认为高脂肪摄入会损害肠屏障，这主要是基于小鼠特殊饮食干预的研究结果，即小鼠78%的卡路里摄入来自不含碳水化合物膳食配方中的脂肪。后续研究已经表明，HFD消耗对肠道屏障完整性的影响很大程度上取决于宿主状态和肠道细菌定植。5）含糖物质消耗增加与人类肥胖风险有关。但普通糖由大部分果糖组成，而果糖会加重肥胖并发症，如肝脏疾病。与摄入葡萄糖水的小鼠相比，尽管摄入卡路里相同，但摄入果糖补充水小鼠的肥胖率有所增加。与HFD小鼠相比，高糖饮食啮齿类动物体重增加和肥胖往往不那么明显，但血糖控制同样受到了负影响。6）大多数实验性肥胖诱导饮食缺乏人类饮食的复杂性和多样性，或许可以解释啮齿动物为什么在喂食这种食物时通常不会表现出明显或持续过量摄食情况。小鼠从标准低脂饮食过渡到HFD后第一天出现暴饮暴食，但随后逐渐减少其摄取量接近对照饮食组的摄入水平。有一种更好地模拟临床肥胖人群表现出的享乐性过度食欲替代方法，即在自由饮食中，啮齿类动物可以自由地吃到几种不同的可口高能量“垃圾”食物（除了普通的食物和水）。因此，和高脂饮食组相比，自由饮食组有助于出现显著的体重增加和更严重的糖尿病症状。 饮食诱导肥胖的表观遗传：疾病特征是否通过精子和卵母细胞传递给后代仍然存在争议。在自然受精条件下的啮齿动物研究发现，亲代HFD饲养后代将延续肥胖和葡萄糖耐受不良的表型。然而，自然繁殖下，子宫环境、哺乳和亲代微生物群落、行为差异等因素会干扰对现象的解释。对低脂饮食或HFD的亲代小鼠精子和卵细胞进行体外受精，并使用健康个体进行代孕，发现其中一组避开了混杂因素清楚地证明了DIO和胰岛素抵抗的表观遗传。这一发现与人类的流行病学数据相一致，该数据表明后代的BMI与亲代的肥胖程度相关，而葡萄糖耐量的降低与母亲而不是父亲的血糖控制受损存在更显著地相关。生殖细胞的转录组、蛋白质组和代谢组的变化及其基因甲基化组中特征标记的改变是传递代谢表型的表观基因组信息的潜在候选者，因此肥胖动物模型研究中最好选择同窝出生仔作比较。 二、基因型啮齿动物模型 单基因小鼠模型：在20世纪60年代，杰克逊实验室的科尔曼及其同事发现并分离了两种突变小鼠种群，即严重肥胖轻度糖尿病（ob）种群和中度肥胖严重糖尿病（db）种群。ob/ob小鼠的瘦素（当时被称为Ob，现在被称为Lep）存在自发突变导致瘦素缺乏，db/db小鼠存在瘦素信号接收缺陷，这是由Lepr（瘦素受体）自发突变引起的。经常被忽略的是，当这些小鼠处于相同遗传背景时，ob/ob小鼠或db/db小鼠几乎拥有相同的表型。ob/ob小鼠保持了C57BL/6J遗传背景，而db/db小鼠保持了C57BLKS/J遗传背景，遗传背景的差异使得重度肥胖（ob/ob）与重度糖尿病（db/db）表型存在差异。1）在C57BL/6J遗传背景下，ob/ob小鼠表现出早发性肥胖，这种肥胖由过量摄食和能量消耗降低所致，ob/ob小鼠也会出现高胰岛素血症、轻度高血糖和胰岛素抵抗，但ob/ob小鼠不能生育。在C57BLKS/J遗传背景下，ob/ob小鼠明显患有以高血糖严重和胰岛萎缩为特征的糖尿病，以至于容易过早死亡。2）在C57BLKS/J背景下db/db小鼠在很大程度上包含了ob/ob小鼠的肥胖表型。db/db小鼠过度饮食，能量消耗降低，导致早发性肥胖。由于生长素缺乏导致线性生长减少且不孕，并且db/db小鼠的瘦素水平显著升高。db/db小鼠高胰岛素血症可在10天龄被检测到，并且胰岛素水平继续增加直到3个月龄，同时伴有胰岛β细胞增生和肥大。3个月后，db/db小鼠胰岛素水平出现明显下降，该现象与β细胞萎缩有关。然而，db/db模型并不能捕捉到人类所有的糖尿病并发症。CD57BL/6J背景下的db/db小鼠尽管具有明显肥胖表型但表现出轻微的糖尿病症状和正常生命周期。 单基因大鼠模型：肥胖Zucker大鼠为瘦素受体缺陷模型， Koletsky大鼠为自发性高血压型肥胖（SHROB）大鼠。由于GH-IGF1轴活性降低和甲状腺功能减退，这些大鼠出现摄食过度和重度肥胖，同时出现能量消耗减少，葡萄糖耐量受损，胰岛素敏感性受损，生长发育迟缓。纯合子突变的雌性和雄性大鼠不育。此外，与Zucker大鼠相反，Koletsky大鼠从30天开始出现高血压。不管肥胖Zuker大鼠还是肥胖Koletsky大鼠均不易发生糖尿病。ZDF大鼠是通过高血糖症肥胖Zucker大鼠选择性繁殖获得，携带β细胞转录常染色体隐性缺陷，导致出现肥胖合并严重糖尿病综合征，伴有持续和早发性高血糖症，并进展为β细胞死亡、低胰岛素血症和过早死亡。Otsuka Long–Evans Tokushima Fatty (OLETF)大鼠成年时出现慢性高血糖和胰岛素抵抗会发展成糖尿病，出现多尿和多饮等特征性症状。这些大鼠也表现出轻度过度饮食摄入引起的肥胖。OLETF大鼠因为缺乏胆囊收缩素（CCK）受体A型而有助于模型疾病表型发展。这些大鼠还表现出自我校正能量平衡的行为表现，当提供HFD和转轮时，OLETF大鼠的能量消耗大大增加，因此在饮食和肥胖方面与非突变对照大鼠无法区分。 总的来说，代谢性疾病的单基因动物模型对于理解人类特定的基因功能和致肥胖的单基因形式具有一定意义，并且它们已经成为现代药物研究中的重要研究工具。比如研究人员经常使用C57BL/6J背景ob/ob小鼠模型来评估新型抗肥胖药物在由摄食过量引起的肥胖表型中的有效性；C57 BLKS/J的db/db小鼠经常用于抗糖尿病药物的疗效研究。然而，研究人员越来越清楚的是，单转基因动物模型的代谢特征很少能准确地预测生理功能。目前研究已经从449个突变系27000只小鼠系统表型筛选中发现了50多个与葡萄糖稳态、代谢或肥胖表型参数相关的基因座。由这些数据我们可以预期用于肥胖症和糖尿病的单基因动物模型数量将在今后十年中急剧增加。 多基因模型：人类肥胖是一种多基因疾病，同时具有很大的个体间异质性。因此，多基因肥胖易感型啮齿动物模型对于更好地捕捉人类疾病状况很重要。1）C57BL6/J是一种多基因易肥胖小鼠，因为这些小鼠在被置于肥胖环境中时容易由过度摄食发展成肥胖而在实验中被广泛使用。然而，已有研究发现C57BL6/J小鼠对HFD反应具有异质性。在肥胖环境中，大约60%的C57BL6/J小鼠的体重会增加，而其他小鼠体重与标准饮食对照小鼠体重相当。这个发现可能是表观遗传差异的结果，也反映出人类肥胖易感性的多样性。C57BL6/J小鼠6周龄时可通过血浆胰岛素、瘦素水平以及胰岛素敏感性差异区分DIO应答者和非应答者。2）与C57BL6/J小鼠相似，50%左右Sprague Dawley大鼠在HFD中出现肥胖，当低脂饮食时，DIO倾向性（DIO-P）大鼠饮食摄入量和体重与DIO抵抗型（DIO-R）大鼠大致相同，但当喂食HFD时，DIO-P大鼠饲养效率增加，高胰岛素血症、高瘦素血症以及肥胖发展快速。值得注意的是，与DIO-R大鼠相比，DIO-P大鼠在肥胖开始前中枢瘦素和胰岛素敏感性已经降低。DIO-P和DIO-R表型是可遗传的，这使得可获取稳定的DIO-P和DIO-R亚系重现人类多基因肥胖的许多特征。3）沙鼠（Psammomys obesus）是一类营养依赖性早发性肥胖症和相关的糖尿病后遗症的远交多基因模型。以低热量的植物为基础饮食，体型瘦且血糖正常。在实验室环境中，随机给予高能量饮食，沙鼠会在出生3至4周后出现肥胖并发展为高血糖，随后出现T2DM标志性表型，如严重的低胰岛素血症、高脂血症和酮症。与人类T2DM末期相似，糖尿病沙鼠面临β细胞退化、肾病、体重减轻和过早死亡。饲养富含胆固醇饮食，沙鼠还会发展成在形态和功能上与人类病理学相似的非酒精性脂肪性肝炎。通过选择性育种，研究人员还建立了糖尿病易感和糖尿病抵抗的沙鼠队列用来研究饮食和基因在糖尿病和肥胖中的相互作用。4）New Zealand Obese（NZO）小鼠是另一种肥胖和T2DM近交系多基因小鼠，NZO小鼠的肥胖是由中度过量摄食、能量消耗降低和自发性活动减少所诱导。这些作用伴随瘦素信号转导失调和与胰腺、肝脏功能缺陷相关的血糖紊乱。在4-5周龄，NZO小鼠棕色脂肪组织和骨骼肌中表现出胰岛素抵抗。无碳水化合物饮食的NZO小鼠尽管有明显的胰岛素抵抗和肥胖，但血糖仍保持正常，当改用含碳水化合物饮食时，饮食对胰岛有显著影响，包括RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT)活化的丧失、葡萄糖转运体GLUT2的表达降低和某些对于胰岛素合成和β细胞完整性必要的转录因子的减少。这使得该模型适于评估新疗法预防碳水化合物介导的β细胞衰竭能力。与临床情况相似，NZO小鼠T2DM发病明显取决于早期的肝脂肪变性程度。当10周龄肝脏脂肪含量＜10%时，NZO小鼠免受高血糖和β细胞缺失造成的影响。如适度卡路里限制或间歇性禁食（每隔一天禁食）的饮食干预也可以保护NZO小鼠免受高血糖症的影响。5）TALYHOH/Jng（TH）小鼠是一个近交多基因T2DM模型，表现为中度肥胖。TH小鼠脂肪组织和骨骼肌中胰岛素刺激的葡萄糖摄取减少，胰腺形态和功能出现异常，在很多方面出现类似于临床多基因T2DM症状。尽管出现高胰岛素血症和肥胖，雌性TH小鼠仍保持正常血糖。TH小鼠出现骨密度降低，使其成为研究T2DM和骨骼之间相互作用的一个模型。6）加州大学(UC) Davis-T2DM （UCD-T2DM ）大鼠模型是通过成年肥胖Sprague Dawley大鼠和瘦素受体野生型但β胰岛细胞和/或胰岛缺陷导致胰岛素抵抗的ZDF瘦型大鼠杂交发展成具有显著性高血糖特点的T2DM模型。UCD-T2DM大鼠存在葡萄糖刺激性胰岛素分泌障碍，空腹和喂食后葡萄糖浓度分别超过250mg/dl和450mg/dl，在糖尿病发病后3-4个月内，其HbA1c>7%。该大鼠在低脂、低糖饮食中会发展成T2DM，并且雌雄个体都会受到影响，雄性糖尿病发病时间(~4-8月龄)比雌性更早(~8-12月龄)。UCD-T2DM大鼠出现许多T2DM并发症，包括蛋白尿、椎间盘损害、骨结构和功能受损、脑和/或神经元可塑性和代谢出现缺陷。由于它们是瘦素应答型大鼠，UCD-T2DM大鼠能生育，不像瘦素缺乏的ZDF大鼠那样不孕不育。总的说来，UCD-T2DM大鼠是一种通用的啮齿动物模型，可用于开发、评估、治疗和预防T2DM及其后遗症。 总之，选择合适的模型用于代谢研究，确保该模型适合于特定的研究问题是科研人员面临的最大挑战。对于临床前药物开发设计，采用易感多基因模型用来评估药物的功效和安全性，有利于采用遗传功能缺失模型进行后续治疗靶点验证。 胰腺β-细胞功能障碍啮齿动物模型：大多数T2DM多基因啮齿动物模型从胰岛素抵抗到T2DM伴随β细胞衰竭继发于肥胖（如TH小鼠、沙鼠和NZO小鼠等）。与此相反，Goto- Kakizaki（GK）大鼠是一种非超重多基因T2DM模型，GK大鼠存在新生β细胞缺陷，当出现慢性高血糖、炎症和氧化应激时，β细胞代谢和功能缺陷的后果是胰岛结构破坏和β细胞数降低，这使得GK大鼠成为研究β细胞衰竭与T2DM之间相互联系的模型。其他β细胞功能障碍研究模型如年轻阶段出现成熟糖尿病（MODY），MODY是若干遗传糖尿病类型的总称，这类糖尿病是由必需β细胞特异基因自发突变发展而来的，大概占所有糖尿病病例1%。MODYs可运用个性化治疗研究，例如，KCNJ11的突变导致钾通道转录缺陷，该缺陷可导致人类新生儿糖尿病，如果检测出则可以使用磺酰脲类药物进行有效处理。而过表达导致钾通道缺陷的转基因小鼠出现高血糖和β细胞去分化，也可通过磺酰脲或胰岛素治疗逆转。Gck基因突变（临床为MODY2）和Hnf1a基因突变（临床为MODY3）分别诱导小鼠糖耐量受损和胰岛素分泌不足。临床上，MODY4由PDX1中杂合突变引起的，Pdx1杂合小鼠成年后出现高血糖症，β细胞特异性Pdx1缺失诱导β细胞丧失。在Foxa2-Venus Fusion(FVF)、 Pdx1-BFPFusion(PBF)双纯合子(FVFPBFDHom)小鼠中出现了与MODYs相似的表型，成熟β细胞受损和β细胞缺失触发β细胞转分化为其他内分泌细胞类型从而造成β细胞数量减少并诱发糖尿病。有趣的是，雌性FVFPBFDHom小鼠没有糖尿病表型，然而，在孕期它们可发展为妊娠期糖尿病。因此，FVFPBFDHom小鼠由于融合荧光蛋白而成为具有追踪β细胞能力的性二态性糖尿病模型。 机械性或化学诱导糖尿病模型 化学或机械损伤胰腺可诱发实验性糖尿病。该技术必需经过专门技术训练且需配套的手术设备，还需消除外分泌胰腺消化酶和其他胰岛激素的混杂效应的影响，因此限制了胰腺切除术的广泛应用。而化学方法，如致糖尿病药物链脲佐菌素或四氧嘧啶，针对分泌胰岛素的β细胞为目标进行造模。这两种药物都是细胞毒性葡萄糖类似物，对GLUT2转运体具有高度亲和力，主要靶向作用于β细胞。比起四氧嘧啶，链脲佐菌素因其具有更好的稳定性和更小的毒性而颇受欢迎。一种常采用的方法是将HFD与低剂量腹腔注射（~30-40mg/kg）链脲佐菌素相结合，以模拟从糖尿病前期胰岛素抵抗状态到明显的T2DM转变。这种非遗传模型的主要优势在于研究人员可以模拟出类似临床大多数T2DM患者缓慢发病机制的整个过程，包括从成人发病DIO到葡萄糖不耐受、胰岛素抵抗、由此产生的代偿性胰岛素释放，到最后链脲佐菌素诱导的部分β细胞死亡。 小结 除了上述肥胖、糖尿病动物模型，还有很多其他用于研究的动物模型，比如非哺乳动物（秀丽隐杆线虫、果蝇、斑马鱼）由于生命周期短（便于长期及后代定量研究）及高通量分析（实现全基因RNAi文库构建），用于初步探索和完善高等生物基础性概念分析；大型动物（如猪、比格犬）可以实现肝门静脉、肝和肾静脉插管取血等方面的需求而被采用；非人灵长类动物在基础研究和临床研究之间起着关键的桥梁作用而被重视。到目前为止，许多类器官模型还不能取代哺乳动物模型用于研究代谢疾病中的关键因素，如食物摄入量、营养分配、体脂分布、全身葡萄糖代谢、大脑控制代谢通量等。对具体疾病动物模型存在的潜在不良副作用和毒性研究也是必不可少的，从而有效保护临床健康志愿者和连续临床研究的患者。对于任何转化研究来说，以正确的顺序和组合来选择模型并考虑生成数据和提供结论时模型存在的缺点对任何后续研究都是至关重要的，未能选择适当的动物模型进行研究将阻碍疾病机制、诊断以及更安全、有效的潜在治疗药物的发现和发展。 Kleinert M, Clemmensen C, Hofmann S M, et al. Animal models of obesity and diabetes mellitus. Nature Reviews Endocrinology, 2018, 14(3). |
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