| 查看: 1207 | 回复: 0 | |||
[交流]
盘点医药研究领域使用毕赤酵母表达的几大蛋白
|
|
毕赤酵母表达系统具有易于高密度发酵，能使产物有效分泌并适当糖基化、培养方便经济等特点，已基本成为非常完善的外源基因表达系统。在医药蛋白领域，已有胰岛素、乙肝表面抗原、人血清蛋白、表皮生长因子等多种蛋白使用毕赤酵母表达并实现商品化制备。大量的实例已经证实毕赤酵母表达系统为高效、实用、简便，可提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，非常适宜于扩大为工业规模。 毕赤酵母目前已是仅次于大肠杆菌的最常用蛋白表达系统，广泛应用于实验室规模的蛋白质制备、表征以及结构解析等方面，已有上千种蛋白在毕赤酵母系统中得到成功地表达。美迪西科研人员建立了成熟的酵母表达纯化服务平台，提供优质的重组蛋白在毕赤酵母和酿酒酵母中的表达与纯化服务。 1、使用毕赤酵母表达系统表达胰岛素 糖尿病是一种由遗传和环境因素相互作用而引起的临床综合症，其基本病理特征为绝对或相对性胰岛素分泌不足所引起的代谢紊乱。作为最重要的降血糖药，胰岛素对胰岛素缺乏的各型糖尿病均有效，具有巨大的市场需求。因此开发生产胰岛素的新途径、优化现有生产胰岛素的手段一直是医药生物化学领域的一个重要课题。 毕赤酵母是近年发展起来的蛋白表达体系，其醇氧化酶基因启动子是诱导型强启动子，可用来调控外源蛋白的表达。该系统具有操作技术简单，可进行高水平的胞内或胞外表达，及对表达产物进行翻译后修饰与加工等显著优点。利用基因重组技术构建高效表达胰岛素前体的甲醇毕赤酵母工程菌株，可发酵生产人胰岛素。 2、乙型肝炎表面抗原 乙型肝炎(Hepatitis B，HB)是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B viurs，HBV)引起的世界范围的传染性疾病，其囊膜蛋白乙肝表面抗原HBsAg，能够诱导机体产生保护性抗体乙肝表面抗体HBsAb，是乙肝疫苗的主要成分。同时，HBsAg也是ELISA诊断免疫是否成功的主要试剂成分，大量制备HBsAg在预防和检测乙型肝炎方面有重要意义。 HBsAg作为诊断HBV感染最重要也是最常用的标志物，“a”决定簇的基因区的突变导致其HBsAg不能被一些市售诊断试剂盒中的单克隆抗体或多克隆抗体识别，因此提高HBsAg试剂盒的临床灵敏度和突变体的识别能力是必要的。目前HBsAg突变体的种类很多，其中以G145R最常见也最重要，也是主要研究对象。建立毕赤酵母表达系统，开展HBsAg和其突变体G145R的表达和纯化，并对这两种蛋白进行初步研究，可以为进一步完善HBsAg诊断试剂盒及其变异检测的研制奠定一定的基础。 3、肿瘤坏死因子 研究表明，将人类肿瘤坏死因子相关凋亡配体(TRAIL)生物活性部分在巴斯德毕赤酵母中分泌表达发现发酵液中分子量约为19kD和38kD的蛋白质能被TRAIL多克隆抗体特异性识别，且具有在体外诱导肿瘤细胞凋亡的活性。通过薄层扫描分析显示目的蛋白最高可占可溶性总蛋白的36%。通过实验结果表明，在巴斯德毕赤酵母表达系统中表达的TRAIL能以寡聚体的形式存在并且具有生物学活性。 4、表皮生长因子 构建并筛选出重组人表皮生长因子(rhEGF)高表达的毕赤酵母基因工程菌株，于30L发酵罐进行中试发酵按1:15接种15 L FBSM发酵，pH 6.0、28～30 ℃、DO 20%～30%、流加甲醇诱导发酵42 h，rhEGF的表达量可达1g/L。采用疏水层析、离子交换柱层析及分子筛凝胶层析的方法分离纯化rhEGF，获得的rhEGF试制品的纯度大于95%，得率在40%以上。通过基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)测定rhEGF的分子质量与理论分子质量一致。N端蛋白序列分析仪分析其N端氨基酸序列，测序结果与理论的氨基酸序列一致。采用Balb/c 3T3细胞增殖/MTT比色法测定其活性，测定rhEGF的活性为1.0×106 IU/mg,与WHO标准品相当。该研究实现了毕赤酵母高效表达rhEGF并纯化得到符合《中国药典》标准的rhEGF,为工业化生产rhEGF提供基础。 5、人血清蛋白 人血清白蛋白是一种在医学上应用广泛，需求量大的蛋白质药物。而目前血浆提取生产的方式难以满足市场的要求，用基因工程方法生产人血清白蛋白无疑具有巨大的商业价值。由于巴斯德毕赤酵母表达系统自身的许多优点，使得其在表达外源蛋白中具有十分大的优势。用巴斯德毕赤酵母构建并筛选分泌重组人血清白蛋白(rHSA)基因工程高产菌株，并对其发酵纯化条件进行初步研究。免疫印迹检测所表达的rHSA具有免疫原性。 6、抗体 经分步整合法在巴氏毕赤酵母中表达人抗狂犬病毒全分子抗体。方法分别构建人重链和轻链抗体表达质粒，以分步整合法电转化X33酵母菌，甲醇诱导表达后进行ELISA筛选及Western blot分析。结果SDS-PAGE、Western blot检测均在分子量约55kD及25kD处出现特异性条带，ELISA检测显示所获全分子抗体具有良好的狂犬病毒抗原结合活性，表达量约8～10mg/L。结论在毕赤酵母菌中可经甲醇诱导产生具狂犬病毒抗原结合活性的分泌型人全分子抗体。 7、毕赤酵母表达系统的应用前景 （1）表达具有生物活性的功能蛋白 作为一种正在发展中的表达异源蛋白的宿主菌，毕赤酵母具有真核生物的翻译后加工修饰的特点是能够得到广泛应用的最大魅力所在。 （2）表达医用产品 利用毕赤酵母系统可以生产医用高效蛋白质，如用毕赤酵母生产的重组蛋白有牛胰蛋白酶原、人2A型蛋白磷酸酯酶(PP2A)亚基、乙型肝炎病毒前S1蛋白、戊型肝炎病毒开读框架2片断、人白介素-2、肿瘤坏死因子。另外肿瘤细胞的一个关键的蛋白酶MT1-MMP，在删去C末端跨膜区后，转化酵母并获得表达，这对于癌症的治疗有重要的意义。 （3）毕赤酵母可作为研究一些重要理论和科研的有力工具 毕赤酵母的表达产物可用于结构的研究用毕赤酵母表达系统表达了15N标记的大麦非特异性脂转移蛋白2型(ns-LTP2)，在严格控制生理、生化条件及连接条件的情况下，获得的ns-LTP2蛋白可用于进行精细结构的研究。 随着酵母遗传学及生物学研究的进一步深入，人们越来越多地应用毕赤酵母作为外源基因的表达系统。其在功能蛋白的生产上、商业产品的开发和科学研究上将发挥越来越重要的作用。 |
回复此楼» 猜你喜欢
Nature一直在编辑手里，考虑好几天了，是悬了吗
已经有7人回复
-
博士生招生！！
已经有5人回复
-
国社科项目，你们学校都限额申报吗？
已经有8人回复
-
企业博后是否能申请CSC博士后项目？谢谢
已经有6人回复
-
博士白读了
已经有40人回复
-
申博求助
已经有6人回复
-
两类问题算是白选了~
已经有10人回复
-
CSC的访问学者申请，没有个评审意见，也不知道怎么改，还有必要申请吗
已经有4人回复
-
普通院校药学硕士，做合成的，感觉找不到工作
已经有9人回复
-
研二光催化6月底四篇二区什么水平
已经有10人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
66