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【调剂】北京石油化工学院2024年16个专业接受调剂
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moyu墨鱼

新虫 (小有名气)

[求助] PCR问题已有2人参与

提取土壤中的总DNA后，对长度为162bp 的tetG抗生素抗性基因进行PCR扩增，凝胶成像上在100―250bp Marker之间有很微弱的条带，这能说明总DNA中含有这种基因但没扩增成功吗？还是说明总DNA中不含这种基因？求指教

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1楼2018-10-18 23:44:12
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xie45518

新虫 (正式写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2018-10-19 08:30:15
再pcr提高循环次数，应该是有条带的

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抓住时间，就抓住了一切。
2楼2018-10-19 08:11:46
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zouyina

银虫 (小有名气)
是不是PCR条件没有优化

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3楼2018-10-19 08:41:56
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moyu墨鱼

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zouyina at 2018-10-19 08:41:56
是不是PCR条件没有优化

在养猪场取的土就P出了清晰的条带，实验条件没啥变化，是提取的土壤总DNA不纯的原因吗？

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4楼2018-10-19 08:51:23
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moyu墨鱼

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xie45518 at 2018-10-19 08:11:46
再pcr提高循环次数，应该是有条带的

都是循环35次，以前在养猪场土样中P出了清晰的条带，这次是农田土壤

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5楼2018-10-19 08:54:23
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bangh

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
换个方法，比如荧光定量PCR，灵敏度高一些容易判断。凝胶电泳分辨率可能不够
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6楼2018-10-19 10:55:10
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moyu墨鱼

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by bangh at 2018-10-19 10:55:10
换个方法，比如荧光定量PCR，灵敏度高一些容易判断。凝胶电泳分辨率可能不够

我这个是准备先普通PCR，凝胶成像有目的基因的再上qPCR跑。我看文献基本都是这个过程。

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7楼2018-10-19 12:44:28
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zouyina

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by moyu墨鱼 at 2018-10-19 08:51:23
在养猪场取的土就P出了清晰的条带，实验条件没啥变化，是提取的土壤总DNA不纯的原因吗？
...

Maker条带亮度够么？如果marker没问题的话，可以测一下提取的DNA质量，就是260/280.  另外控制模版上样量不要超过50ng/25ul体系。

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8楼2018-10-19 14:25:15
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moyu墨鱼

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by zouyina at 2018-10-19 14:25:15
Maker条带亮度够么？如果marker没问题的话，可以测一下提取的DNA质量，就是260/280.  另外控制模版上样量不要超过50ng/25ul体系。
...

我又试了一下sul2和sul3的PCR。如图，前两个是养猪场土样，只有sul2有条带且亮度较亮。后面六个分别是3个不同地方的普通农田土样。都只有sul2有条带，但是特别暗。我的PCR循环35次，上样模板1ul，体系为50ul。土样的总DNA条带亮度和宽度都差不多。纯度没测，但是以前测的其他土样A260/A280≈1.8，浓度在30―60ng/ul之间。农田土壤中到底该怎么优化PCR条件才会有清晰的条带呢？麻烦帮忙看看，非常感谢！
PCR问题



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9楼2018-10-19 21:28:18
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zouyina

银虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by moyu墨鱼 at 2018-10-19 21:28:18
我又试了一下sul2和sul3的PCR。如图，前两个是养猪场土样，只有sul2有条带且亮度较亮。后面六个分别是3个不同地方的普通农田土样。都只有sul2有条带，但是特别暗。我的PCR循环35次，上样模板1ul，体系为50ul。土样 ...

相比于农田土壤，抗性基因在猪粪污染的土壤中浓度高亮度高是正常的，我觉得你这个结果正好说明这个现象是正确的呀。不知道你想要提高目的条带的亮度是为什么，如果你想定量的话可以用qPCR，如果只是想提高亮度的话可以尝试增加循环数。

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10楼2018-10-20 18:20:18
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