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nigga4life

新虫 (初入文坛)

[求助] 想请大神帮我设计一下3/5Race的巢式引物,小妹感激不尽!已有1人参与

如题,我在做一个未测序植物的基因克隆,核心区段已经测出,现在就差末端了,一连设计了许多引物都跑不出来。现在实验处于瘫痪状态,不停烧钱却出不了成果,老板都有意见了...而且老板怀孕了成了甩手掌柜....实在是没辙了,想让论坛里的大神帮忙设计下巢式引物,这是第一次做巢式,之前做的touchdown跑不出,但是毫无思路,而且对自己设计的引物质量没有信心。如果有大神愿意出手相助的话,真的感激不尽!本人用的是clontech的SMARTer® RACE 5’/3’ Kit试剂盒。@biostar2009@wizardfan@youlinglyw
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我欲乘风归去

木虫 (正式写手)

有钱人啊,race都有试剂盒。3race应该很好扩增才对,5race有点麻烦。
2楼2018-08-14 22:25:48
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nigga4life

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 我欲乘风归去 at 2018-08-14 22:25:48
有钱人啊,race都有试剂盒。3race应该很好扩增才对,5race有点麻烦。

都扩不出

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3楼2018-08-15 00:42:33
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chenpp2006

新虫 (正式写手)

都不需要试剂盒的。3R比较容易,反转录引物和通用引物都能查到,常规操作就Ok。在常规反转录cDNA的5'端加多个G或C,相当于加了adaptor,可以直接用于5R扩增。都不用试剂盒的。你自己多找几篇文献看看,中文的就有几篇吧

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4楼2018-08-15 03:57:21
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Agonilb

新虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by chenpp2006 at 2018-08-15 03:57:21
都不需要试剂盒的。3R比较容易,反转录引物和通用引物都能查到,常规操作就Ok。在常规反转录cDNA的5'端加多个G或C,相当于加了adaptor,可以直接用于5R扩增。都不用试剂盒的。你自己多找几篇文献看看,中文的就有几 ...

您好,我也是第一次做,用的几年前师姐剩的盒子反转录的,通用引物也是盒子里的,PCR的酶我用的TaKAaRa 的LA Taq酶,,没有做巢氏,但是5’RACE能做出来条带,菌检出来的菌测序总是不合适,要么就是无信号,不知道要怎么解决,还请您帮我分析一下,谢谢

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5楼2018-08-15 08:46:26
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chenpp2006

新虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by Agonilb at 2018-08-15 08:46:26
您好,我也是第一次做,用的几年前师姐剩的盒子反转录的,通用引物也是盒子里的,PCR的酶我用的TaKAaRa 的LA Taq酶,,没有做巢氏,但是5’RACE能做出来条带,菌检出来的菌测序总是不合适,要么就是无信号,不知道 ...

巢式PCR还是要做的。第一轮和第二轮产物一起跑胶,如果条带大小差异和预计的一样,基本可以确定是目的片段。

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6楼2018-08-15 11:00:40
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chenpp2006

新虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by Agonilb at 2018-08-15 08:46:26
您好,我也是第一次做,用的几年前师姐剩的盒子反转录的,通用引物也是盒子里的,PCR的酶我用的TaKAaRa 的LA Taq酶,,没有做巢氏,但是5’RACE能做出来条带,菌检出来的菌测序总是不合适,要么就是无信号,不知道 ...

有的时候第一轮是看不到扩增的,第二轮的时候做单引物扩增的对照

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7楼2018-08-15 11:01:44
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Agonilb

新虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by chenpp2006 at 2018-08-15 11:01:44
有的时候第一轮是看不到扩增的,第二轮的时候做单引物扩增的对照
...

第一轮从来没有看到过条带,我是做两次PCR,用的同一个引物,只是第二次用的模板是第一次的产物。能出来条带,就是菌检不行。

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8楼2018-08-15 12:08:55
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Agonilb

新虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by chenpp2006 at 2018-08-15 11:01:44
有的时候第一轮是看不到扩增的,第二轮的时候做单引物扩增的对照
...

嗯嗯,行,谢谢你,那我再做做巢氏看看,

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9楼2018-08-15 12:09:42
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chenpp2006

新虫 (正式写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by Agonilb at 2018-08-15 12:08:55
第一轮从来没有看到过条带,我是做两次PCR,用的同一个引物,只是第二次用的模板是第一次的产物。能出来条带,就是菌检不行。
...

第二轮最好不要用同样的引物,很容易出现非特异扩增。而且两轮用同样的引物就不能叫做巢式PCR了

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10楼2018-08-15 19:48:44
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