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Cacl2制备的大肠杆菌EC1000感受态老是转化不成功，寸草不生！！！已有5人参与
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购买的大肠杆菌EC1000感受态和PORI280质粒，用Cacl2法制备EC1000感受态，怎么做都转化不出来。急急急！！！ 感受态制备方法如下： 37℃温箱培养12-16 h后，挑取生长良好的单个菌落，接种于5 mL LB液体培养基中，37℃，250-300 r/min振荡培养5-6 h。 2）将适量活化后的菌液无菌转接到装有50 mL LB的盐水瓶中，继续振荡培养约2.5-3 h，至OD600nm值达到0.5-0.6时，在无菌条件下将细菌转移到一个无菌的用冰预冷的50 mL聚丙烯离心管中，冰上放置30 min。 3）4℃ 4000 r/min离心10 min，弃上清，将离心管倒置1 min使残留培养液流尽后，于沉淀中加入10 mL冰预冷的0.1 mol/L CaCl2重悬沉淀，冰浴30 min。 4） 4℃ 4000 r/min离心10 min，弃上清，沉淀中加入用冰预冷的0.1 mol/L CaCl2约2 mL（视细菌量而定），轻轻重悬菌体，即为制备好的感受态细胞，可直接取少量（约100 μL）马上用于转化或放冰浴中置4℃短期存放（一般于3 d内用完）。可加入终浓度15%无菌甘油，分装0.1 mL/管，-70℃冰箱保存备用。 转化方法： 把感受态细胞置于冰中融化。 2. 把100uL的感受态细胞移至灭菌处理的试管内。 3. 加入用于转化的DNA（10 ng以下）。 4. 冰中放置30分钟。 5. 42℃ 放置90秒。 6. 冰中放置5分钟。 7. 加入37℃预温好的SOC培养基，使终体积为1 ml。 8. 37℃振荡培养1小时（160～225 rpm）。 9. 6000rpm 离心，弃上清，保留100uL左右菌液重悬混匀后吸取并涂布琼脂平板培养基。 10. 37℃过夜培养。 CaCl2也重新买了sigma分装的，同时转化PORI280质粒和PUC19质粒，PORI280的涂布的是红霉素抗性SOC平板和LB平板，PUC19涂布的是氨苄抗性的SOC平板和LB平板，PORI280平板没有长菌落，PUC19平板长了菌落，我用PCR检测和小提质粒跑胶检测都未检测到阳性菌落。 怎么破呀！！！！  |
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2楼2018-08-11 10:53:34
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fengjunchen
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snoopytbw: 金币+3, 鼓励交流 2018-08-13 12:55:39
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按理说钙转很简单的。看你写的方法感觉没啥问题啊。我做钙转比较粗犷，有几点跟你的做法不一样，不过感觉都不会有啥大影响。 1、我使用的菌液是OD600=0.4的，250ml锥形瓶50ml LB摇的，个人使用感觉比0.5的效率高，只是感觉啊并无文献支持。2、由于我做感受态纯是现配现用，所以不考虑冻存，在更换CaCl2的几步离心时不会等时间；在加入质粒后才冰浴静置30min。3、我加的质粒量比较多，50ng/ul的质粒溶液我会加5ul，复苏后涂板时是一块儿板把1ml全涂掉，一块儿板沾取菌液划线；这做法虽然不合常规但还挺有效的，过量的质粒保证转化成功，效率就算很低的话1ml的板也能有几十个菌落，效率正常的话菌落数会过多 但划线的板也能挑出足够的单菌落做验证。4、我热激时是42度45秒或60秒，这个大概是个人习惯，我记得好像是看过文献有提到45s-90s均可，印象不太清晰了。 最后说一句，氨苄我挺常用的，那平板37度16小时以上长出来的菌落，真是不太可信；但16小时以内的感觉没啥假阳性啊，顶多是质粒自连没插进去目的片段，倒不至于没有抗性质粒。 |
4楼2018-08-13 12:45:05
ylc6351
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