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【调剂】北京石油化工学院2024年16个专业接受调剂
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寻一束光

铁虫 (小有名气)

[求助] 关于杆状病毒表达系统的一些问题？已有1人参与

关于杆状病毒表达系统的一些问题？
1.如果我不测滴度的话，按照理论P3滴度是不是大于1X108了，那么我表达蛋白的时候能不能就按照1X108，MOI值5 来计算病毒加入的量，这样对表达量影响大么？
2.收菌的时间是48-72h,72h的时候已经有一些细胞破碎了，细胞活力在70-80%，我看手册上说，“Harvest the virus when 70–80% of cells are dead”是不是说收获的时候细胞活力只有20%，那岂不是很多细胞都破碎了，蛋白不就被降解了么？文献又有说细胞活力在90%的时候收，所以我就很困惑，什么时间收比较好
3.表达后，菌液高压破碎后特别稠，堵柱子，流过液中也有目的蛋白（带6个His-tag），感觉不挂柱，纯化的时候洗了好多梯度，蛋白还是很杂。
小白入门，求大神指点
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静心尽力
1楼2018-07-19 15:49:07
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圣混沌凡

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
drwhoknowss: 金币+1, 鼓励交流 2018-07-25 04:04:55
寻一束光: 金币+10 2018-08-21 19:42:03
1，2两点不确定，但第三点可能是由于破菌不彻底造成的，在裂解菌液后会释放出大量的核酸，这些核酸需要尽可能的打断，不然就会造成破菌后菌液粘稠。
这些粘稠的核酸会影响挂柱效果。
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2楼2018-07-24 23:20:10
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明明就之杪

禁虫 (初入文坛)
本帖内容被屏蔽
3楼2018-08-20 11:36:42
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寻一束光

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 圣混沌凡 at 2018-07-24 23:20:10
1，2两点不确定，但第三点可能是由于破菌不彻底造成的，在裂解菌液后会释放出大量的核酸，这些核酸需要尽可能的打断，不然就会造成破菌后菌液粘稠。
这些粘稠的核酸会影响挂柱效果。

感谢回复，高压1000pa,破碎的4次，网上说破碎太多，蛋白不是也会被破坏，所以就不敢破碎那么多次，我准备加点核酸酶试试~
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静心尽力
4楼2018-08-21 19:40:59
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寻一束光

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 明明就之杪 at 2018-08-20 11:36:42
你好，我想问你的蛋白是什么性质的呢？

是一个蛋白激酶
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静心尽力
5楼2018-08-21 19:41:38
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digimanual

新虫 (初入文坛)
1、滴度对蛋白表达的影响没那么大，实验用的蛋白你估计一下MOI就足够了。大不了你感染两份，滴度相差5倍。
2、我的经验感染后4-5天外源蛋白才到最高值，3天还是太早了。你说的细胞裂解的很厉害，我推测是病毒加的太多了。表达时间你可以看看这里的照片：bacmid.com
3、我都是用超声波破碎细胞，还没遇到你说的粘稠的情况。另外，上柱子的时候你把细胞裂解液弄稀一些，我觉得你的样品太浓了。
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6楼2018-09-15 13:23:30
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SivanLi

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 寻一束光 at 2018-08-21 19:40:59
感谢回复，高压1000pa,破碎的4次，网上说破碎太多，蛋白不是也会被破坏，所以就不敢破碎那么多次，我准备加点核酸酶试试~...

想问一下阿婆主菌液浓稠堵柱子的问题用上述的方法解决了吗？我也遇到了这个问题，谢谢阿婆主了
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7楼2018-11-27 21:39:33
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水晶蛋蛋

铜虫 (小有名气)
1.“Harvest the virus when 70–80% of cells are dead”这里说的是胞内表达
2.文献又有说细胞活力在90%的时候收。这里说的是分泌表达
每种情况不一样所以对细胞活力的要求不一样。
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8楼2019-10-09 12:27:37
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