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【调剂】北京石油化工学院2024年16个专业接受调剂
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爱上走神

新虫 (初入文坛)

[交流] 半定量pcr结果咨询,主要是溶解曲线不太看的懂

各位大神,最近在做半定量pcr,首先我做的是引物的扩增效率,求助各位,溶解曲线在最高峰后面有一个峰,不太明白是哪里的问题,求助各位大神!

半定量pcr结果咨询,主要是溶解曲线不太看的懂
这个是该引物的溶解曲线,后面出现的两个峰是怎么回事呢?


半定量pcr结果咨询,主要是溶解曲线不太看的懂-1
这个是该引物的扩增效率图,我做的时候用的是cDNA,模板以10倍稀释,稀释了4次,加上模板,一共五个,每个浓度做三个重复。谢谢各位!
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用户晓晓

木虫 (正式写手)

★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
爱上走神: 金币+2, 谢谢 2018-06-15 00:12:10
溶解曲线就是反应产物情况的,一个峰说明只有一种产物,不同的峰就是有不同的产物。

但是!!!从您的描述来看,你只用了一对引物,该引物大多数孔的情况都很好单一峰,只有两个孔的峰不正常(就是你说的后面的那个峰),这个应该不是引物的问题。

异常的孔通常问题可能很复杂,不好判断,这样的孔的CT值应该是没有参考意义的。可能的原因是浓度过高 或者过低,或者这两个孔操作有问题,种种吧。

但是问题是,楼主下面的标准曲线拟合的挺好的,没有发现那两个异常值,是楼主给那两个值剔除了吗?


总之,引物应该没有问题,标准曲线貌似OK,cDNA浓度也适合,可以下一步试验了。

建议楼主重复一次看看。
2楼2018-06-14 13:49:38
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爱上走神

新虫 (初入文坛)

曲线是没有踢出异常数据的,这个就是我很疑惑的地方,异常数据只体现在溶解曲线上。标准曲线的r2这个值好像也有点异常,所以不太明白,谢谢用户晓晓的解答,欢迎您继续解惑谢谢!

发自小木虫Android客户端
3楼2018-06-15 00:11:32
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cventbio

新虫 (初入文坛)

★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2018-06-21 13:46:38
如果要深究另外几个孔的情况,得看扩增曲线,纯荧光曲线,最后是源文件上比较判断。这样才有意义。就两张图 二楼的解释很棒
www.cventbio.com 荧光定量、无缝链接、单克隆......
4楼2018-06-15 14:46:30
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爱上走神

新虫 (初入文坛)

其余条件不变,加大引物用量,解决了这个问题,谢谢两位大神的帮助,祝您们生活快乐!

发自小木虫Android客户端
5楼2018-06-19 21:34:27
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