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石耀强

金虫 (小有名气)

[商家供应] 一款好用的无冰工作站,简直方便的不要不要的

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内容

是否还在等待制冰机产冰去做PCR,去做冰浴?
是否还在找因冰化成水后混乱的样品?
是否还在擦台面上因冰水浴产生的水渍?
是否想高效的做PCR,做连接,做一切需要冰的实验?
无冰工作站能够做到,CoolHome就是这样一款产品。
值得拥有!
                                                                                                  PCR扩增 HBV-S基因
一.基本原理
PCR是一种体外由引物介导的特定DNA序列的酶促扩增技术。其前提是一对人工合成的15-20bp的寡核苷酸引物,其序列与待扩增的DNA两侧的碱基序列互补。PCR包括下列三个基本步骤:①变性:待扩增的DNA模板加热变性成单链;②复性:降低温度,使单链靶序列与两侧对应的寡核苷酸引物互补结合;③延伸:在适当条件下,利用耐热DNA聚合酶(常用Taq酶)使引物延伸,产生新的双链。经过上述变性、退火、延伸步骤的25-35次循环,导致特异的靶序列的2n指数扩增。
    本实验的扩增产物为淋HBV-S全长基因750bp的DNA片段。
二.材料
1)模板:以上一步实验所得的DNA为模板。
2)StartTaq热启动酶
3)PCR扩增引物的设计
根据HBV-S基因序列用软件Primer5设计出一对HBV-S基因扩增引物,引物由上海生工合成,其序列如下:
S1: 5'-GGAATTCATGGAGAACATCACATCAGG-3';
         EcoR I
S2: 5'-CGGCGGCCGCAATGTA—TACCCA AAGAC-3';
          Not I
4)二甲基亚砜
5)10×PCR 缓冲液(含Tris-HCl 100mmol/L; MgCl2  15mmol/L 、KCl 500mmol/L, pH8.3,
0.1%明胶)
6)脱氧核苷三磷酸dNTPs:配成 10mM- dATP ,dTTP,dGTP,dCTP 各10mM ,用NaOH 溶液调节至pH8.3。)
7)水:要求不含DNA聚合酶抑制剂,不含离子,一般为去离子二蒸水(ddH2O ), 灭菌以后即可使用。
三.仪器
1)PCR仪    Thermo Hybaid
2)水平式琼脂糖凝胶电泳槽
3)恒压电泳仪    Bio-Rad
4)凝胶成像仪 JY04S—3C       北京君毅东方
5)垂直流超净工作台        上海智域分析仪器制造有限公司
6)微量加样器
四.方法
1.PCR扩增体系(50μl)
以所提取的DNA为模板,利用S1和S2为引物进行PCR扩增的反应体系如下:
D2H2O        33μl          PCR扩增条件                  94℃预变性5min
10XBbffer   5μl                       94℃   40sec
前引物      1μl                      60℃   1min18sec    35 cycles   
后引物      1μl         50μl          72℃   2min
dNTPs(1:1:1:1)4μl                                   72℃ 10min
Taq DNA聚合酶   1μl                                      
模板DNA     5μl                                   1.5%琼脂糖凝胶电泳判断结果
在冰浴中进行加样。
2.TBE凝胶电泳:取5ulPCR产物在质量浓度为1.5%的TBE琼脂糖凝胶上电泳,Goldenview染色,紫外灯下观察结果。
3.结果
扩增的HBV-S基因片段长度为750bp
     
五.技术要点
1. 实验前,可按所做管数,将缓冲液与酶加在一支EP管内,混匀后得到PCR反应液。按每管20μl分成若干管。这样可保证各管中反应体系的均一性和酶的准确吸取。
2. 由于PCR具有超敏感性的特点,极微量的污染便可导致假阳性结果。在实验的各个步骤要防止污染。
3. 反应管中加好所有的试剂后,应立即上机扩增,以免形成过多的二聚体。
4. PCR各组份的配制与加样量要特别注意。
(1)  引物浓度:10pmol足够30个循环,浓度太高导致与模板非特异结合增强,扩增非特异片段增多,浓度太低则扩增效率低。
(2)  引物的配制:厂家提供的引物一般是干粉状态并标明 OD值,1OD约含 33μg。开盖前先将干粉离心至管底,加双蒸水至浓度 2μg/μl,再取部分稀释至 10pmol/μl。
引物浓度计算公式:1pmol=(3.3×10-4μg) ×n         n是引物的碱基数
(3) Mg2+:使用浓度一般在 1.5mM,要求模板不含高浓度EDTA和诸如硫酸基团类的负电荷基团,Mg2+浓度升高可导致错配率升高和非特异性扩增。
(4) 模板 DNA:浓度不可过高,DNA 20ng 即可,若需第 二次扩增,可将第一次扩增产物稀释 1000-10000 倍作为模板使用。
(5) Taq DNA 聚合酶:一般用量 5U/100μl。酶量过大易导致扩增非特异序列,Taq 酶具有末端转移酶活性,常在 3’端加A。
(6) 全程低温操作,聚合酶以及引物不能在常温下稳定存在,这是尤为重要的一点。
在我做实验的时候,采用了无冰工作站,全程低温,无水渍做完PCR。
它的操作简单,甚至不需要操作,闲时把冷冻芯放在冷冻冰箱即可,用时再拿出来。
它的保冷效果很好,0℃-4℃就是0℃-4℃,不会使液体结冰,也不会产生太多水渍。比较干爽的0℃-4℃。
它的试管模块选择多样,有1.5mL和2mL离心管的,也有PCR管的,各种模块都有。
有了它,做实验再也不需要打冰,擦水渍,找样品。做PCR,抱着工作站去操作台就可以了,做完,抱着走就了事。非常的省时省力。
  以下是说明书的介绍:
CoolHome是一种台式的新型的节能,环保,安全,标准化无添加物的冷冻装置,它在无电,无冰或电池的情况下可以全天候低温冷冻样品。拥有更长时间低温保存和更精准的温控范围,可视的温度,以及高度稳定导热性能,实现产品标准化的冷冻系列操作。CoolHome的应用非常灵活,适用于不同的样品和温度。模板的设计使它能满足通用装置。根据所用的冷冻芯的不同,CoolHome-X型冷冻芯能使样品在0℃-4℃下冷冻超过14小时,CoolHome-X1型冷冻芯能使样品在-20℃-0℃下冷冻超过14小时,CoolHome-X2型冷冻芯能使样品在-22℃到-18℃下冷冻超过6小时。CoolHome也可与干冰共同使用,为细菌,病毒,蛋白质等建立一个紧凑,可携带及速冻的装置。减少冰引发的问题,例如样品温度的改变,核酸酶中RNA的降解和微生物对培养的污染。非常适于使用在组织培养罩或其他需要无菌操作的地方。

产品特点:
没有冰,电和电池的情况下可为样品提供全天的冷却或冻结。
X,X1,和X2型冷冻芯能提供所需的冷源,以达到所需的温度。
适用于多管导热管和模块,包括自动化友好样品模块。
精准的温控,孔与孔之间的温度保持一致,保证样品实验结果一致性。
用酒精易于清洁及高温,紫外线等多种方式消毒。
耐用的外层材料不会吸收液体,如果掉落也不会摔破。高度耐用,适用于频繁。。。
自动化友好的样品模块和可用的装置可用于短暂的移动冷样品到自动仪器中处理。
简易方便的读数模块,随时读取BlockHome的即时温度。

使用方法:
CoolHome易于组装和使用。只需简单的把冷冻芯存储在-80℃或-20℃的冷冻箱中若干小时。
使用时挑选相应的能量芯插入到CoolHome的基底中。
把需要的BlockHome试管模块放在冷冻芯上,然后插入您的试管或板样品到CoolHome样品模块中即可。
倘若选用干冰,将冷冻芯拿出,直接填充300-400ml在原本放置冷冻芯的位置后再将BlockHome试管模块放在干冰上即可。
X,X1冷冻芯若是从-80℃环境中拿出,可先在室温放置10分钟后再插入基座中,以便消除过低的表面温度。

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石耀强(金币+1): 谢谢参与
3楼2018-06-11 17:45:42
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