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【调剂】北京石油化工学院2024年16个专业接受调剂
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ffffang1234

新虫 (初入文坛)
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8楼: Originally posted by 渊博震天 at 2018-06-08 06:45:17
我所说的跑胶是指通过跑胶来再一次验证你的目的基因和载体的浓度，以takara的marker为例，上样5ul，最亮的条带浓度为150ng/ul，其余的均为50ng/ul。针对你的目的基因PCR来看，浓度稍低，你的条带特异性高不？ ...

我的目的基因也是直接从质粒上双酶切得到的，您认为失误是由于载体和目的片段浓度较低吗？低浓度这样会影响转化效率吗？
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11楼2018-06-08 15:40:27
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ffffang1234

新虫 (初入文坛)
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9楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2018-06-08 11:50:40
你用什么引物扩增，用什么菌转化？

用的homemade的大肠杆菌感受态转化，引物是特异性的引物，分别是载体和目的片段的引物扩增
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12楼2018-06-08 15:41:41
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渊博震天

版主 (职业作家)

Yeast Display

优秀版主优秀版主
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11楼: Originally posted by ffffang1234 at 2018-06-08 15:40:27
我的目的基因也是直接从质粒上双酶切得到的，您认为失误是由于载体和目的片段浓度较低吗？低浓度这样会影响转化效率吗？...

浓度能高点的话最好
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13楼2018-06-08 16:20:23
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jurkat.1640

铁杆木虫 (文坛精英)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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12楼: Originally posted by ffffang1234 at 2018-06-08 15:41:41
用的homemade的大肠杆菌感受态转化，引物是特异性的引物，分别是载体和目的片段的引物扩增...

用DH5α转化连接产物成功率高
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14楼2018-06-08 16:25:08
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ffffang1234

新虫 (初入文坛)
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14楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2018-06-08 16:25:08
用DH5α转化连接产物成功率高...

好的，谢谢您的建议。
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15楼2018-06-08 16:47:42
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汀语言

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你质粒和片段浓度好低啊，我觉得你应该换个凝胶回收试剂盒，还是说你回收加水加多了。你最好把你的连接体系贴出来，我做连接一般载体与片段比用1：5，有时可能是1：10。连接酶(东盛)2μL,载体2μL，片段总体积2μL（加水补齐）。连接体系6μL。转化到50μL的商品化DH5α感受态中。
长满板子的菌落有可能都是阴性，比如你的抗生素用错，或是抗生素失效。
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16楼2018-06-08 16:53:45
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ffffang1234

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 汀语言 at 2018-06-08 16:53:45
你质粒和片段浓度好低啊，我觉得你应该换个凝胶回收试剂盒，还是说你回收加水加多了。你最好把你的连接体系贴出来，我做连接一般载体与片段比用1：5，有时可能是1：10。连接酶(东盛)2μL,载体2μL，片段总体积2μL（ ...

我的回收产物最后加水25ul，但是看电泳条带应该回收产物不止这么多。可能是胶回收的时候回收率太低了
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17楼2018-06-08 18:48:23
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