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【求助】连接转化大肠杆菌，菌落PCR跑不出条带已有4人参与
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新人诚恳求教： 我拿三条质粒用双酶切分别切开得到一个载体和两个目的片段构建两种重组质粒。 双酶切产物切胶回收电泳图如下： 从右往左分别是marker（10kb），71（取较下方目的片段），72（取上方载体片段），73（取下方目的片段） 这些质粒的大小分别是：71：11.8kb（目的片段2.6kb），72：10.5kb(载体片段9.2kb)，73：11.8kb（目的片段2.6kb） 但是切胶回收后分别以72作为载体和71，73的片段连接构成两个重组质粒并且转化到大肠杆菌却一直失败。 一开始我认为是insert和vector的量不够（起初做的是25ng的载体，10ul连接体系），转化出的大肠杆菌一个板子只有不到20个菌落，挑单克隆做菌落PCR也看不到条带。后来又重新建立连接体系，载体量加到50ng，按照1：3的比例调整后涂板，其中一个板子上长满了菌，另一个还是很少（30多个菌落）。 我又分别挑了24个单菌落进行PCR，结果还是阴性。 目前已经通过对照排除了PCR引物的问题和大肠杆菌感受态的问题，连接产物单独拿出来做PCR是可以扩增出来目的条带的，现在就是不明白长满了板子的菌落真的都会是阴性吗？到底问题出在哪里呢？求高手帮忙指点！  双酶切.png |
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微笑静淌
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2楼2018-06-07 22:49:20
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7楼2018-06-07 23:37:02
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我所说的跑胶是指通过跑胶来再一次验证你的目的基因和载体的浓度，以takara的marker为例，上样5ul，最亮的条带浓度为150ng/ul，其余的均为50ng/ul。针对你的目的基因PCR来看，浓度稍低，你的条带特异性高不？如果高的话可以考虑多P几管，进行PCR产物纯化回收进行浓缩提高浓度。想提高载体浓度可以多酶切几管合并一管回收 发自小木虫Android客户端 |
8楼2018-06-08 06:45:17
jurkat.1640
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