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ffffang1234

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助】连接转化大肠杆菌,菌落PCR跑不出条带已有4人参与

新人诚恳求教:

我拿三条质粒用双酶切分别切开得到一个载体和两个目的片段构建两种重组质粒。

双酶切产物切胶回收电泳图如下:

从右往左分别是marker(10kb),71(取较下方目的片段),72(取上方载体片段),73(取下方目的片段)

这些质粒的大小分别是:71:11.8kb(目的片段2.6kb),72:10.5kb(载体片段9.2kb),73:11.8kb(目的片段2.6kb)

但是切胶回收后分别以72作为载体和71,73的片段连接构成两个重组质粒并且转化到大肠杆菌却一直失败。

一开始我认为是insert和vector的量不够(起初做的是25ng的载体,10ul连接体系),转化出的大肠杆菌一个板子只有不到20个菌落,挑单克隆做菌落PCR也看不到条带。后来又重新建立连接体系,载体量加到50ng,按照1:3的比例调整后涂板,其中一个板子上长满了菌,另一个还是很少(30多个菌落)。

我又分别挑了24个单菌落进行PCR,结果还是阴性。

目前已经通过对照排除了PCR引物的问题和大肠杆菌感受态的问题,连接产物单独拿出来做PCR是可以扩增出来目的条带的,现在就是不明白长满了板子的菌落真的都会是阴性吗?到底问题出在哪里呢?求高手帮忙指点!

【求助】连接转化大肠杆菌,菌落PCR跑不出条带
双酶切.png
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微笑静淌

新虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
超级亮  是不是你做菌液PCR 加样有问题,我今天也做了,第一次全是空载,第二次连空载也没跑出来

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2楼2018-06-07 22:49:20
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渊博震天

实习版主 (职业作家)

Daryl


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
切胶回收后的质粒浓度?是用仪器测的吗?有没有跑胶

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跌跌撞撞中成长
3楼2018-06-07 22:50:08
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微笑静淌

新虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
我也不信 全是阴性

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4楼2018-06-07 23:02:09
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ffffang1234

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 渊博震天 at 2018-06-07 22:50:08
切胶回收后的质粒浓度?是用仪器测的吗?有没有跑胶

nanodrop测的质粒浓度
载体是18 ng/ul
两个目的片段的浓度分别是4.6和7.5 ng/ul
后来也跑胶看了一下回收产物,都是和目标大小一致的
5楼2018-06-07 23:17:22
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ffffang1234

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 微笑静淌 at 2018-06-07 22:49:20
超级亮  是不是你做菌液PCR 加样有问题,我今天也做了,第一次全是空载,第二次连空载也没跑出来

我做的是菌落PCR,用当时做转化对照组的质粒转化长出来的菌落作为对照也跑出来条带了,应该不是加样的问题
6楼2018-06-07 23:18:41
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微笑静淌

新虫 (小有名气)


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质粒浓度不是很高 为何双酶切 胶回收后条带如此亮 你提质粒摇了多少菌 取了多少做双酶切  你的提质粒试剂盒是神魔牌子?

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7楼2018-06-07 23:37:02
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渊博震天

实习版主 (职业作家)

Daryl


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by ffffang1234 at 2018-06-07 23:17:22
nanodrop测的质粒浓度
载体是18 ng/ul
两个目的片段的浓度分别是4.6和7.5 ng/ul
后来也跑胶看了一下回收产物,都是和目标大小一致的...

我所说的跑胶是指通过跑胶来再一次验证你的目的基因和载体的浓度,以takara的marker为例,上样5ul,最亮的条带浓度为150ng/ul,其余的均为50ng/ul。针对你的目的基因PCR来看,浓度稍低,你的条带特异性高不?如果高的话可以考虑多P几管,进行PCR产物纯化回收进行浓缩提高浓度。想提高载体浓度可以多酶切几管合并一管回收

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跌跌撞撞中成长
8楼2018-06-08 06:45:17
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jurkat.1640

禁言 (知名作家)


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9楼2018-06-08 11:50:40
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ffffang1234

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 微笑静淌 at 2018-06-07 23:37:02
质粒浓度不是很高 为何双酶切 胶回收后条带如此亮 你提质粒摇了多少菌 取了多少做双酶切  你的提质粒试剂盒是神魔牌子?

双酶切的质粒是拿之前别人做好的,具体浓度71和73大概是900ng/ul,72是600ng/ul
提取质粒的试剂盒是promega的
10楼2018-06-08 15:37:10
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