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馒头Lucy

新虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白质SDS-PAGE电泳,银染无条带,求大神帮忙看看!已有2人参与

蛋白质SDS-PAGE电泳,银染无条带,只有Marker有条带,其他的样品只有泳道,如图。跑了很多次,之前也有过模糊的条带,换了很多种方法,做了很多次,也不知道是什么问题,求大神指点一二,很急!

蛋白质SDS-PAGE电泳,银染无条带,求大神帮忙看看!


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maoniuniu

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
能否介绍的更详细些?包括你用的是什么试剂?自己配的?还是试剂盒?

另,实验第一次有问题的话,后面一定要加上一些对照组,这里可以加上BSA作为对照组,你可能觉得marker已经染出来了,试剂和方法应该没问题,但marker的量太大,而且是商品化的,还是有个你自己准备的第三方最为对照比较好

另,为什么一定要银染,某些条带量太少吗?或者要看纯度?

祝好!
2楼2018-05-18 17:16:14
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maoniuniu

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
2楼: Originally posted by maoniuniu at 2018-05-18 17:16:14
能否介绍的更详细些?包括你用的是什么试剂?自己配的?还是试剂盒?

另,实验第一次有问题的话,后面一定要加上一些对照组,这里可以加上BSA作为对照组,你可能觉得marker已经染出来了,试剂和方法应该没问题, ...

还有一点,你一定确定你跑上去的样品就没有问题吗?从条带上看,并不是没有条带,只是非常弥散,可能没有你想看到的特异条带,所以确定自己的样品没有问题吗?
3楼2018-05-18 17:18:25
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馒头Lucy

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by maoniuniu at 2018-05-18 17:16:14
能否介绍的更详细些?包括你用的是什么试剂?自己配的?还是试剂盒?

另,实验第一次有问题的话,后面一定要加上一些对照组,这里可以加上BSA作为对照组,你可能觉得marker已经染出来了,试剂和方法应该没问题, ...

胶是自己配的,10%的分离胶,4%的浓缩胶,样品加了Loading buffer
蛋白质SDS-PAGE电泳,银染无条带,求大神帮忙看看!-1


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4楼2018-05-18 19:36:55
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馒头Lucy

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by maoniuniu at 2018-05-18 17:18:25
还有一点,你一定确定你跑上去的样品就没有问题吗?从条带上看,并不是没有条带,只是非常弥散,可能没有你想看到的特异条带,所以确定自己的样品没有问题吗?...

为什么会弥散呢?看Marker跑得还行应该不是我胶的问题吧?样品的话是粗酶液

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5楼2018-05-18 19:40:36
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maoniuniu

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引用回帖:
5楼: Originally posted by 馒头Lucy at 2018-05-18 19:40:36
为什么会弥散呢?看Marker跑得还行应该不是我胶的问题吧?样品的话是粗酶液
...

看protocol什么的没有问题

marker都是商品化的,一般没有问题,我得意思是你制备的样品是否有问题,粗酶液是如何来的?自己纯化或是粗提纯的?

看上去你的跑胶和银染应该问题不大,当然你银染加个BSA做对照会更好,所以怀疑你自己的样品是否有问题?假如说样品有问题,降解或者纯化的不好,都会导致,可以从这方面检查一下

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6楼2018-05-18 21:12:41
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馒头Lucy

新虫 (初入文坛)

粗酶液是发酵过后用纯水浸提、离心得到的,还有的样品是硫酸铵分级沉淀再超滤脱盐浓缩所得,我现在加了BSA跑,看看结果是不是样品的问题

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7楼2018-05-19 15:24:18
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zh910917

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引用回帖:
6楼: Originally posted by maoniuniu at 2018-05-18 21:12:41
看protocol什么的没有问题
marker都是商品化的,一般没有问题,我得意思是你制备的样品是否有问题,粗酶液是如何来的?自己纯化或是粗提纯的?
看上去你的跑胶和银染应该问题不大,当然你银染加个BSA做对照会更好, ...

想问下,如果用BSA跑的话,BSA用PBS溶解,加上样缓冲液,加热煮沸5分钟,离心跑是否可以呢?

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8楼2018-09-11 16:17:36
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maoniuniu

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引用回帖:
8楼: Originally posted by zh910917 at 2018-09-11 16:17:36
想问下,如果用BSA跑的话,BSA用PBS溶解,加上样缓冲液,加热煮沸5分钟,离心跑是否可以呢?
...

没问题,它只是做个对照,一般煮个十分钟更充分一些。假如你需要用它做个上样量对照,或者是染色灵敏度对照,可以上个梯度。祝好!

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9楼2018-09-11 21:05:28
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zh910917

新虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by maoniuniu at 2018-09-11 21:05:28
没问题,它只是做个对照,一般煮个十分钟更充分一些。假如你需要用它做个上样量对照,或者是染色灵敏度对照,可以上个梯度。祝好!
...

你好,那个颜色比较深的便是牛血清蛋白,它是上阳量多了吗?把其他泳道也污染了?
蛋白质SDS-PAGE电泳,银染无条带,求大神帮忙看看!-4



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10楼2018-09-12 09:42:57
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